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论文方法介绍-环境样品中亚硝酸盐含量测定方法研究

2021-04-13 11:35:42

  本研究旨在选择一种对人体、环境低毒或无毒的显色剂用于环境样品中亚硝酸盐含量的测定。经过预实验,可以将碱性品红分光光度法作用于亚硝酸盐含量的测定中,并且对测定的条件进行了优化。结果表明:亚硝酸盐的回归方程Y=0.0015X+0.2967,相关系数为0.9992,线性范围:1.0-1000μg/L,亚硝酸盐加标回收率为96.1%-104.0%。此方法操作过程简单,结果准确可靠,在环境样品中亚硝酸盐含量测定分析中非常适用。

  1.1亚硝酸盐

  亚硝酸盐,一类无机化合物的总称。通常指亚硝酸钠,亚硝酸钠极易溶于水,味道带微咸,颜色为浅黄色或白色,形状为粉末或微粒。外观及滋味都与食盐相似,并在工业、建筑业中广为使用,肉类制品中也允许作为发色剂限量使用[1]。身为环境污染物的它们却广泛地存在于大自然中,主要是在蒸气水、陆地水和地下水中以及动物和植物体中与食物内。

  1.1.1亚硝酸盐的中毒机理及危害

  强氧化剂的亚硝酸盐通过某种方式进人人体后,在里面发生氧化反应,把血中低铁血红蛋白转化为高铁血红蛋白,让其失去正常运行的功能,缺少了氧气的运送,导致使组织缺氧造成青紫而中毒,亚硝酸盐中毒病发迅疾,通常情况下的潜伏期为1~3h,在食入食物时有较高的机率会引起亚硝酸盐中毒。只需0.3~0.5克的亚硝酸盐进入体内将会导致中毒甚至死亡发生。中毒的性状是因为血红蛋白失去作用导致组织缺氧造成青紫现象,如口唇、舌尖、手指发紫,重者眼结膜、面部及浑身皮肤青紫。头疼、乏力、头晕、烦躁、呼吸困难、腹痛、腹泻、恶心、呕吐、特重者晕厥、惊厥、大小便失禁,非常严重者呼吸衰竭而死亡。

  1.1.2亚硝酸盐过量常见原因

  因为过量施用氮素肥料或使用方式不对,比如蔬菜在准备收获前不久施用氮肥,会使蔬菜其食物中累积过量的硝酸盐,再遇有利于某种还原菌生长环境,都可以促使硝酸盐还原为亚硝酸盐[2]。某些肉产品在生产加工时,将硝酸盐或亚硝酸盐当作“染色剂”,使腌制肉维持鲜红色,使之口感提升与和相貌改善并且阻止肉毒杆菌进行繁殖衍生导致食品腐坏。如果不以国家用量标准来使用食品添加剂,过度的添加也会让食用的人食物中毒。在蔬菜腌制的过程中加食用盐使用不够或腌制的时长不够,导致大量繁殖的还原菌把蔬菜里的硝酸盐还原为亚硝酸盐,因此食用了腌制不合格的蔬菜的人也会引起亚硝酸盐中毒。误将亚硝酸盐当作食用盐食用者也是形成急性亚硝酸盐中毒的一个主要因素。食物里的亚硝酸盐大多以硝酸盐还原转化产生的。硝酸盐是大自然中普遍存在的一种无机化合物,在人们所食用的食物和饮用水里都均含有一定量的硝酸盐,正常状况下硝酸盐含量非常少,不至于使人中毒,但在某些状况下,食物里硝酸盐的含量剧增,非常容易使人中毒。如果食物里存在着过多硝酸盐,原核生物的还原酶在一定条件下就会把硝酸盐还原为亚硝酸盐,过多的亚硝酸盐存在食物里,将会导致中毒、致癌、死亡的重要原因。硝酸盐过量的存在于食物里的重大问题,已经受到了广大科学界与食品卫生监督人员的高度关注和重视。因此,国家卫生标准规定,GB 5749-2006生活饮用水中NO2-≤1.0 mg/L,GB 8537-2008矿泉水中NO2-≤0.1 mg/L[3]。

  1.2目前的测定方法

  现在常用于测定水中亚硝酸盐的测定方法有重氮偶合分光光度法,该方法主要是亚硝酸根离子与4-氨基苯磺酰胺(4-aminobenzene sulfonamide)反应产生重氮盐后再与N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐[N-(1-naphthyl)-1,2-diaminoethane dihydrochlo-ride)]偶联生成红色染料,在538 nm波长处测定吸光度[4,5]、在符合安全规定下使用盐酸萘乙二胺方法进行测定亚硝酸盐的含量,此方法高精度非常高,再现性好,随着试剂储存时间变长颜色越深,容易被其他杂质的干扰,使用试剂拥有较大的毒性,可使环境和分析人员形成危害,引发二次污染。催化分光光度法是将一定量的磷酸、甲基红、溴酸钾加入比色管中并且摇匀,放入100℃水浴中升温一段时间,取出放入冷水降到常温,测定吸光度,所用的有机染料主要是偶氮染料、三苯甲烷类染料蒽醌染料与对氮染料等。这类反应大部分都需要在加热条件下进行,而且反应的条件的控制要求比较严格,稳定性有待提升。间隔流动分析法[6]、化学发光法等[7]。

  1.3本课题的研究目的及意义

  在大学学习中测定亚硝酸盐的方法是重氮偶合分光光度法,该方法需要在弱酸性条件下进行,亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后,再跟盐酸奈乙二胺偶合生成紫红色化合物,亚硝酸盐含量与颜色的深度成正比[8],其最大吸收波长为538 nm,可以对吸光度并进行测定与标准比较定量。该方法中的盐酸奈乙二胺和生成物(毒性更强)均具有致癌性,并且操作繁琐,因此本实验对测定亚硝酸盐进行试验方法的改进,本实验旨在研究一种简便、环保的测定亚硝酸盐含量的分析方法,通过对实验条件的摸索最终得到有利于实验教学,探索出一种对人体不致癌且无危害的显色剂,摆脱传统的方法。

  2实验材料与仪器

  2.1材料和药品

  表1药品种类

  药品纯度生产厂家

  甲基红AR天津市光复精细化工研究所

  甲基绿AR天津市化学试剂研究所

  刚果红AR上海试剂三厂

  中性红AR上海市三爱思试剂有限公司

  碱性品红AR上海四浦有限公司

  氢氧化钠AR天津市致远化学试剂有限公司

  硼砂AR天津市致远化学试剂有限公司

  磷酸AR天津市致远化学试剂有限公司

  亚硝酸钠AR天津市致远化学试剂有限公司

  2.2主要仪器

  表2仪器名称

  名称型号生产厂家

  紫外分光光度计S54上海棱光技术有限公司制造

  可见分光光度计721—100型上海菁华科技仪器有限公司

  电子天平FA1004N型上海菁海仪器有限公司

  常规仪器:烧杯、滤纸、滴定管、移液管、容量瓶等。

  3实验方法

  3.1显色剂的选择

  通过动力学测定法找出一个类似于甲基红等染料的具有较高灵敏度的显色剂[8,9],主要通过对各种显色剂的化学结构,性质的初步鉴定,先预对甲基红,甲基绿,刚果红,中性红,碱性品红等显色剂使其在酸性的环境中进行重氮化反应[10-12]。

  (1)找五个容量瓶,并且编号1、2、3、4、5,分别加入1 mL中性红溶液、1mL甲基红溶液、1 mL甲基绿溶液、1 mL碱性品红溶液、1 mL刚果红溶液分别加入五个容量瓶中。

  (2)在五个容量瓶中逐个加入1 mL亚硝酸盐标准样液和5 mL磷酸溶液,将每个容量瓶放都在5℃的水浴锅当中持续20 min后,观察现象。

  (3)在不同的波长下测定吸光度,算出摩尔吸光系数(A=εbc)。

  3.2反应机理的探究

  由于亚硫酸盐与亚硝酸盐性质相似,通过大量文献的查阅,故可以将亚硫酸盐与碱性品红的反应机理应用于亚硝酸盐当中。

  3.2.1测定方法

  准确移

  取1 mL浓度为5μg/mL的NO2-标准溶液,并且加入5 mL磷酸溶液与0.5 mL碱性品红溶液置于25 mL容量瓶中,使用蒸馏水添加至刻度线。将其放入5℃的水浴锅中冷却20 min,在波长为540 nm处的,利用2 cm比色皿在可见分光光度计下测定吸光度。

  3.2.2溶液的配置

  (1)亚硝酸钠标准溶液:在电子天平上准确的量取0.0500 g亚硝酸钠后,置于硅胶干燥器中进行24小时烘干,加入水进行溶解后将其倒入到250 mL容量瓶中,并且加入蒸馏水至刻度线。可以得到每毫升为200μg亚硝酸钠的溶液。

  (2)亚硝酸钠标准使用液:在使用前,将2.50 mL的亚硝酸钠标准倒入100 mL容量瓶中并加入蒸馏水至刻度线,可以得到每毫升为5μg亚硝酸钠的溶液。

  (3)配置pH不同的溶液:通过变换磷酸溶液和氢氧化钠溶液之间的配比从而配制出pH不同的溶液。

  (4)配置1%的磷酸溶液:准确称取2.5 mL磷酸溶液(38%)溶解置于100 mL的容量瓶中,用蒸馏水稀释到刻度线。

  (5)准确称量:0.034 g碱性品红进行溶解,转于100 mL的容量瓶中使用蒸馏水定溶到刻度线,可以得到1 mmol/L的碱性品红溶液;准确称量0.029 g中性红进行溶解,转于100 mL的容量瓶中使用蒸馏水定溶到刻度线,可以得到1 mmol/L的中性红溶液;准确称量0.027 g甲基红进行溶解,转于100 mL的容量瓶中使用蒸馏水定溶到刻度线,可以得到1 mmol/L的甲基红溶液;准确称量0.061 g甲基绿进行溶解,转于100 mL的容量瓶中使用蒸馏水定溶到刻度线,可以得到1 mmol/L的甲基绿溶液;准确称量0.069 g刚果红进行溶解,转于100 mL的容量瓶中使用蒸馏水定溶到刻度线,可以得到1 mmol/L的刚果红溶液。

  3.2.3光谱条件的选择

  准确移取浓度为1%的磷酸溶液4.0 mL,浓度为1 mmol/L的碱性品红溶液0.5 mL于25 mL的容量瓶中,加入蒸馏水对该溶液进行定容,放置10 min,用2 cm的比色皿,用紫外分光光度计在200 nm-700 nm波长范围内全波长测定,确定其最大吸收波长。

  3.3单因素实验

  3.3.1磷酸体积的影响

  分别准确移取浓度为5μg/mL的NO2-标准溶液1 mL于五个25 mL容量瓶当中,分别将1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL磷酸溶液分别加入到容量瓶中,最后分别加入0.5 mL碱性品红溶液,并用蒸馏水添加至刻度线,在5℃的烧杯里放置20 min,在波长540 nm处,用2 cm比色皿在可见分光光度计当中测定吸光度。

  3.3.2 pH值的影响

  准确移取浓度为5μg/mL的NO2-标准溶液1 mL,在加入5 mL磷酸溶液,最后加入0.5 mL碱性品红溶液于25 mL容量瓶当中,通过变换磷酸和氢氧化钠之间的体积比使其pH值控制在2、4、6、8、10、12。在5℃的烧杯中,放置20 min,在波长540 nm处,用2 cm比色皿在可见分光光度计当中测定吸光度。

  3.3.3温度的影响

  准确移取浓度为5μg/mL的NO2-标准溶液1 mL,在加入5 ml磷酸溶液,最后加入0.5 mL碱性品红溶液于25 mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度线。分别将容量瓶放在0℃、5℃、10℃、20℃、30℃的烧杯中20 min,在波长540 nm处,用2 cm比色皿在可见分光光度计当中测定吸光度。

  3.3.4反应时间对吸光度值的影响

  取六个容量瓶,准确移取浓度为5μg/mL的NO2-标准溶液1 mL,在加入5 mL磷酸溶液,最后将0.5 mL碱性品红溶液放入25mL容量瓶中,并用蒸馏水稀释定容。在5℃的烧杯中分别放置5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min,在波长540 nm处,用2 cm比色皿在可见分光光度计当中测定吸光度。

  3.4正交试验设计

  综合单因素实验结果,实验设计方案,选取放置时间(min)、温度(℃)、磷酸体积(mL)、pH四个因素,分别以X1、X2、X3、X4表示,每个变量的低、中、高三个水平分别以-1、0、1进行编码,设计表格后进行最优条件的确定。

  3.4.1标准曲线的绘制

  准确移取浓度为50μg/mL的亚硝酸盐的标准溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 ml于六个25 mL的容量瓶当中,随后加入0.5 mL的碱性品红溶液,加入浓度为1%的磷酸溶液4 mL,用蒸馏水定容至刻度,并在5℃的烧杯中放置15 min。用水作参比溶液在540 nm处测定吸光度。

  3.4.2加标试验

  分别准确移取浓度为5μg/mL的亚硝酸标准溶液1mL、2mL、4mL于三个容量瓶当中,再加入浓度为1 mmol/L的碱性品红溶液0.5 mL,浓度为1%的磷酸溶液4 mL,并用蒸馏水定容至刻度线处,在5℃的烧杯中放置15 min,在波长540 nm处,用2 cm比色皿在可见分光光度计当中测定吸光度。

  3.4.3精密度试验

  分别准确移取浓度为5μg/mL的亚硝酸标准溶液2 mL于三个容量瓶当中,再加入浓度为1 mmol/L的碱性品红溶液0.5 mL,浓度为1%的磷酸溶液4 mL,并用蒸馏水定容至刻度线处,在5℃的烧杯中放置15 min,在波长540 nm处,用2 cm比色皿在可见分光光度计当中测定吸光度。利用公式:

  计算出相对标准偏差。

  3.4.4水样的测定方法

  分别将水样准确移取2 mL于三个容量瓶当中,再加入浓度为1 mmol/L的碱性品红溶液0.5 mL,浓度为1%的磷酸溶液4 mL,并用蒸馏水定容至刻度线处,在5℃的烧杯中放置15 min,在波长540 nm处,用2 cm比色皿在可见分光光度计当中测定吸光度,最后根据标准曲线计算出亚硝酸盐的含量。

  4结果与讨论

  4.1显色剂的选择结果

  4.1.1染料的选择

  表3染料的种类

  显色剂

  甲基红

  中性红

  刚果红

  甲基绿

  碱性品红

  波长(nm)

  518

  618

  488

  630

  540

  ε

  3.19×104 L/mol·cm

  2.16×103 L/mol·cm

  —

  —

  2.17×104 L/mol·cm

  通过观察,发现1号试管颜色变浅,测出其ε=3.19×104L/mol·cm;2号试管呈蓝绿色,从开始至终点颜色基本未发生变化;3号试管颜色也基本不变;4号试管,测出其ε=2.16×103 L/mol·cm;5号试管颜色变浅,测得ε=2.17×104 L/mol·cm。根据相对应的试管的颜色及数据显示,得出较合适的显色剂是碱性品红,因此本实验将采用碱性品红作为显色剂进行后续实验。

  4.1.2反应的机理

  品红染料与亚硝酸盐反应机理,如下:

  NaNO2+H3PO4 NO+H2PO4-+NaH2PO4+H2O

  N+O+H2PO4-

  4.2测定条件的确定

  4.2.1最大吸收波长的确定

  图1碱性品红光谱图

  通过使用紫外分光光度计的扫描,由上图可以看出在540 nm处吸光度最大,即为最佳吸收波长。

  4.2.2单因素实验

  4.2.2.1磷酸浓度的影响

  图2磷酸影响

  由上图可知:当磷酸溶液的体积范围为1-3 mL时随着体积的增加其吸光度数值明显下降,但当磷酸体积范围为3-5 mL时随着体积的增大其吸光度数值变化缓慢故曲线较为平缓。

  4.2.2.2 pH值的影响

  图3 pH的影响

  由上图可知:当pH值在2-8范围内时随着pH值得增加其吸光度数值缓慢增加,而当pH数值在8-12范围内时随着pH数值的增加其吸光度数值迅速增加。

  4.2.2.3温度的影响

  图4温度的影响

  由上图可知:当温度在0-5℃范围内时,随着温度的增加其吸光度数值基本保持不变,而在10-30℃范围内时随着温度的增加其吸光度数值迅速增加。

  4.2.2.4时间的影响

  图5时间的影响

  由上图可知,当时间在0-5 min范围时,随着时间的增加,其吸光度数值下降明显,当时间在10-15 min范围时随着时间的增加其吸光度数值下降但下降趋势十分缓慢,15 min后随着时间的增加其吸光度数值基本保持不变。

  4.2.3正交试验结果

  为了寻找较佳的测定条件,对以上的较佳单因素试验进行正交实验,得到较好的综合测定条件。根据单因素条件设计正交实验,在λ=540 nm处测量各样品的吸光度结果如下表表4、表5所示:

  表4正交设计表

  实验因素单位水平取值

  -1 0+1

  时间/X1 min 5 10 15

  温度/X2℃5 10 20

  磷酸体积/X3 mL 3 4 5

  pH/X4—4 6 8

  表5正交实验结果及分析

  磷酸时间pH温度

  1 0.054 0.098 0.064 0.097

  2 0.054 0.096 0.083 0.099

  3 0.054 0.093 0.097 0.124

  4 0.045 0.098 0.083 0.124

  5 0.045 0.096 0.097 0.097

  6 0.045 0.093 0.064 0.099

  7 0.042 0.098 0.097 0.099

  8 0.042 0.096 0.064 0.124

  9 0.042 0.093 0.083 0.097

  k1 0.162 0.294 0.192 0.291

  k2 0.135 0.288 0.249 0.297

  k3 0.126 0.279 0.291 0.372

  k1/3 0.054 0.098 0.064 0.097

  k2/3 0.045 0.096 0.083 0.099

  k3/3 0.042 0.093 0.097 0.124

  R 0.012 0.005 0.033 0.027

  通过正交试验得各种影响因素对实验的影响程度如下:pH>温度>磷酸>时间,可以得出最优条件,即当温度在5℃,磷酸用量为4 mL,放置时间为15 min时的测定结果是最佳的,因此后面将采用此条件进行试验。

  4.3采用最佳条件的工作曲线

  准确移取浓度为50μg/mL的亚硝酸盐的标准溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于六个25 mL的容量瓶当中,随后加入0.5 mL的碱性品红溶液,加入浓度为1%的磷酸溶液4 mL,用蒸馏水定容至刻度,并在5℃的烧杯中放置15 min。用水作参比溶液在540 nm处测定吸光度。

  表6亚硝酸盐标准曲线

  NO2-含量(μg)

  25

  50

  100

  150

  200

  250

  A

  0.329

  0.379

  0.452

  0.527

  0.602

  0.68

  图6标准曲线图

  通过标准曲线图,得到亚硝酸盐的回归方程Y=0.0015X+0.2967,相关系数为0.9992,所有实验测定均在本工作曲线,线性范围内进行。

  4.4精密度实验

  表7精密度实验结果与分析

  2mlNO2-

  10μg

  S RSD

  样1 0.126 0.128 0.126 0.1267 0.00115 0.91%

  样2 0.127 0.127 0.127 0.1270 0.00071 0.56%

  样3 0.127 0.128 0.127 0.1273 0.00058 0.45%

  4mlNO2-20μg S RSD

  样1 0.217 0.216 0.217 0.2167 0.00057 0.26%

  样2 0.217 0.217 0.218 0.2169 0.00078 0.36%

  样3 0.216 0.216 0.218 0.2167 0.00115 0.53%

  此测定方法的相对标准偏差为0.383%,精密度较高,分析要求符合。

  4.5加标实验

  表8回收率结果

  矿泉水自来水塔河水

  本底值(μg/L)42 130 385

  添加水平(μg/L)5 10 20 5 10 20 5 10 20

  加标后(μg/L)46.9 51.9 62.2 134.8 139.9 150 389.9 395 405.8

  回收率%0.98 0.99 1.01 0.96 0.99 1 0.98 1 1.04

  以碱性品红试剂进行N02-的定量测定的反应,有良好的选择性.对不复杂的样品,如一般水样,经滤纸过滤后直接测定,同时做回收实验,测定结果令人满意,回收率为96.1%-104.0%。

  4.6水样品的处理

  分别将塔河水、自来水、矿泉水通过沉降、过滤等预处理方法,准确移取2 mL水样,随后加入0.5 mL的碱性品红溶液,加入浓度为1%的磷酸溶液4 mL于25 mL容量瓶当中,用蒸馏水定容至刻度,并在5℃的烧杯中放置15 min。用水作参比溶液在540 nm处测定吸光度,最后通过测得的吸光度与亚硝酸盐标准曲线结合最后可以计算出亚硝酸盐的含量[13]。