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论文方式解析-不同栽培方式下几种牧草根围土壤微生物特征研究

2021-03-24 21:49:13

  为了研究不同栽培方式下植物根际微生物群落多样性的变化特征。采用高通量测序技术对小黑麦(Triticale)和箭筈豌豆(Vicia sativa L.)在单播和混播条件下的植物根围土壤样品的土壤理化性质及微生物群落多样性进行分析研究。结果表明,小黑麦与箭筈豌豆在混播的栽培方式下可以获得混播优势,样品细菌中Gp4和sphingomonas(鞘脂单胞菌属)为优势种,真菌中Mortierella(被孢霉属)为优势种,土壤微生物群落组成差别较大。混播方式有利于土壤碱解氮和有机质的积累,混播条件下微生物丰富度指数提高。

  1.1样地概括

  研究样地位于玉树州称多县珍秦镇(经度:E 97°18′00″;纬度:N 33°24′30″,海拔:4269米),青海大学畜牧兽医科学院高寒草地生态观测站。气候为高原大陆性气候,年均气温:-5.6℃~3.8℃,年均降水量:562.2 mm[10]。

  1.2实验设计

  栽培植物为箭筈豌豆(Vicia sativa L.)、小黑麦(Triticumaestivuml),栽培处理方式为箭筈豌豆单播(ZQJWD)、小黑麦单播(ZQXHM)、箭筈豌豆+小黑麦混播(ZQXHMJWD)等3种种植方式,各处理3次重复。

  1.3样品采集

  2018年5月进行种植试验,9月12日赴实验样地,采用土钻法采集各处理植物根围土壤样品,采集各处理土壤样品重复样3份,装入自封袋,低温保存,及时带回实验室进行相关特性测定。

  1.4研究方法

  1.2.1土壤理化性质的测定

  全氮的测定采用凯氏定氮法;全磷的测定采用高氯酸-硫酸法;全钾的测定采取NaOH熔融-火焰光度法;碱解氮测定采用碱解扩散法;土壤速效磷的测定采用0.5mol·L-1NaHCO3浸提-钼锑抗比色法;速效钾采用1N NH4OAc浸提-火焰光度法;土壤有机质的测定采用重铬酸钾容量法[11]。

  1.2.2土壤微生物多样性的测定

  土壤微生物多样性的测定采用高通量测序法:

  (1)基因组DNA的提取:

  利用土壤DNA提取试剂盒(Mobio)提取根围土壤DNA,再利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度,以稀释后的基因组DNA为模板,根据测序区域的选择,进行PCR。

  (2)PCR扩增

  根据PCR产物浓度进行等量混样,对细菌16SrRNA V3+V4区域和真菌ITS1区域分别进行PCR扩增,利用Illumina MiSeq进行测序和分析。

  (3)数据处理

  16S细使菌用RDP、Silva和NCBI 16S数据库比对,ITS真菌使用RDP和Unite数据库对比。得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别,分析转化为原始测序序列,以FASTQ格式存储。通过barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据,并对各样本数据的质量进行质控过滤,得到各样本有效数据,先剔除嵌合体,然后使用Usearch去除序列中非特异性扩增区域序列,再利用blastn比对剔除靶区域外序列。最后,对OUT数目及分布、多样性指数和属水平上的群落结构进行统计分析。

  2结果与分析

  2.1土壤理化性质分析

  根据测得土壤理化性质(表1)可以看出,土样的肥力等级均较高,有机质和全量养分含量丰富。其中,ZQXHMJWD样品中全氮、全磷、碱解氮和有机质的含量最高,而速效钾含量最低;ZQJWD样品的全钾、速效磷含量最高,全氮和有机质含量最低;ZQXHM样品速效钾含量远高于其他两份土壤样本,但全钾、全磷、速效磷、碱解氮的含量最低。

  表1土壤理化性质

  Tab.1 Physical and chemical properties of soil

  样品名称全N(g/Kg)全P2O5(g/Kg)全K2O(g/Kg)碱解N(mg/Kg)速效P(mg/Kg)速效K(mg/Kg)有机质(g/Kg)

  ZQJWD 4.17±0.21c 2.05±0.33b 21.01±0.12a 323±0.22b 20.2±0.30a 110±0.51b 72.95±0.24c

  ZQXHM

  -JWD 4.46±0.32a 2.28±0.28a 19.05±0.37b 346±0.40a 17.0±0.41b 104±0.42b 85.33±0.27a

  ZQXHM 4.29±0.19b 1.78±0.18c 18.18±0.23c 299±0.29c 16.9±0.62c 174±0.38a 77.29±0.39b

  注:同列不同小写字母表示不同地域样品间差异显著(P<0.05),下同。

  Note:Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different regions at the 0.05 level,The same below.

  2.2测序序列分析

  2.2.1测序序列长度分析

  根据高通量测序结果可知,3个样品中细菌(表2)共测得序列为215995条,其平均长度在458bp-460bp之间,通过质量控制之后,有效序列数目为208411,平均长度在416bp-421bp之间分布。样品中真菌(表3)共测得序列为156798条,其平均长度为290bp-311bp,通过质量控制之后所测得的有效序列数目为153245,平均长度在250bp-266bp范围之间。

  表2细菌序列信息

  Tab.2 Bacterial sequence information

  样品名称原始序列数目(条)原始序列平均长度(bp)有效序列数目(条)有效序列平均长度(bp)

  ZQJWD 60619±0.09c 459.17a 59099±0.11c 420.66

  ZQXHMJWD 89878±0.13a 458.33b 87856±0.07a 420.18

  ZQXHM 65498±0.06b 458.51b 61456±0.21b 416.82

  表3真菌序列信息

  Tab.3 Fungal sequence information

  样品名称原始序列数目(条)原始序列平均长度(bp)有效序列数目

  (条)有效序列平均长度(bp)

  ZQJWD 56129±0.19b 290.57b 54866±0.22a 250.81

  ZQXHMJWD 43408±0.23c 310.26a 43309±0.32b 265.58

  ZQXHM 57261±0.15a 292.61b 55070±0.26a 255.52

  2.2.2样品的OTU统计及分析

  从样品中采用随机抽样法随机抽取数据,以抽到的序列数与它们所能代表的OTU数目为依据构建曲线,即为稀释性曲线(rarefaction curve)。用来比较测序数量不同的样本物种的丰富度并说明样品的取样大小的合理性。当稀释性曲线趋于平坦时,说明取样的数量合理。

  图1、2中显示shannon指数稀释曲线在测序数量增加的情况下逐渐趋于平坦,而Goods coverage指数(覆盖率水平)均大于95%,说明测序获取了绝大多数样本信息,能够反映不同栽培方式下几种牧草根围土壤的细菌及真菌群落多样性。

  图1细菌稀释曲线图2真菌稀释曲线

  Fig.1 Bacterial dilution curve Fig.2 Fungal dilution curve

  韦恩(Venn)图是用来统计样品中共有的和独有的OTU的数目,以便直观展现环境样品的OTU数目组成相似性及重叠情况。图3中可见,样品细菌在OUT聚类后共得到10489个OUT,其中有2716个OUT是共有的,样品ZQJWD特有1376个OUT,ZQXHMJWD特有1950个OUT,而ZQXHM特有1755个OUT。图4中可看出,样品真菌在OUT聚类后共得到1833个OUT,其中有162个共有OUT,样品ZQJWD特有525个OUT,ZQXHMJWD和ZQXHM分别有475和326个OUT。

  图3样品中细菌out分布韦恩图图4样品中真菌out分布韦恩图

  Fig.3 Venn diagram of bacterial OTUS distribution Fig.4 Venn diagram of funguns OTUS distribution

  2.3群落组成多样性分析

  Alpha多样性指一个特定区域内的多样性,是反映样品的物种丰富度及物种多样性的综合指标,其中群落丰富度指数主要包括chao1指数和Ace指数,当chao1指数和Ace指数越大,表明群落的丰富度越高;群落多样性指数包括Shannon和Simpson指数,当Shannon指数越高、Simpson指数越小,说明群落的多样性越低。

  由表4可知,本研究的3个样品中共有细菌OTU 18631个,其中ZQXHMJWD的细菌OTU数最高,达到6627;ZQJWD的细菌OTU的数目最低,为5804。ZQXHMJWD细菌的Chao1指数和Ace指数最大,说明混播条件下的细菌群落丰富度最高;ZQJWD的细菌群落丰富度最低。ZQXHM的shannon值最高,Simpson指数最小,即细菌群落多样性越高;相反ZQXHMJWD的shannon指数最低,Simpson指数最高,因此混播条件下细菌群落多样性也最低。

  表4不同栽培方式下几种牧草根围土壤细菌数据

  Tab.4 Bacterial data of soil around roots of several forages under different cultivation methods

  样品名称OUT数Shannon指数Chao1指数ACE指数Coverage指数Simpson指数

  ZQJWD 5804 6.93±0.01 8747.56±0.23 10435.27±0.44 0.96 5.6e-03

  ZQXHM 6200 7.02±0.03 9510.11±0.31 11686.93±0.51 0.95 5.4e-03

  ZQXHMJWD 6627 6.82±0.01 10007.74±0.29 11908.55±0.62 0.97 5.8e-03

  由表5可知,3个样品中共有真菌OTU2502个,其中ZQJWD的真菌OTU最高,达到953;ZQXHM的真菌OUT数最低,为662。就Chao1和Ace指数而言ZQJWD的值为最高的,说明其真菌群落丰富度高,ZQXHM的值最低,说明真菌群落丰富度最低。ZQXHMJWD的shannon值相对较高,则真菌群落多样性最高,ZQXHM的相对较低,则真菌群落多样性最低。

  表5不同栽培方式下几种牧草根围土壤真菌数据

  Tab.5 Data of soil fungi around roots of several forages under different cultivation methods

  样品名称OUT数Shannon

  指数Chao1指数ACE指数Coverage指数Simpson指数

  ZQJWD 953 5.14±0.02a 1019.89±0.31a 1023.78±0.37a 1.00 0.02

  ZQXHM 662 4.28±0.01b 706.62±0.19c 724.30±0.23c 1.00 0.07

  ZQXHMJWD 887 5.15±0.01a 946.69±0.26b 951.37±0.26b 1.00 0.02

  总体来看细菌数量和种类远高于真菌,说明在3个试验样品当中,细菌占据微生物群落的主导位置。所有试验样品的OUT覆盖率(coverage)均大于95%,可以表明本次试验能准确反映出所测样地的微生物多样性情况。即本试验样品中细菌的Chao1和Ace值均远大于真菌,说明所测样品细菌的群落丰富度大于真菌;同理,细菌的shannon值均大于真菌,即所测样品细菌的群落多样性也高于真菌。

  由上述分析可得,不同栽培方式下牧草的微生物群落多样性指数及丰富度指数都有较大差异。综合来看ZQXHM微生物群落多样性最高,而ZQXHMJWD微生物丰富度指数最高,这说明栽培方式的不同对土壤微生物的生存环境确实造成了一定程度上的影响,混播方式有助于增加土壤微生物丰富度。

  2.4群落结构分析

  在属水平上,通过对三个样品测序结果的分析可以得知,样品检测出的微生物种类繁多,为了优化视图效果,柱状图略去了很多含量极少的物种,只显示相对丰度水平靠前的部分优势菌,并将其他物种统称为other,而unclassified代表未能鉴定到的物种。

  从图5中可知,ZQJWD、ZQXHM、ZQXHMJWD的样品中细菌主要分布着以下几个属:Gp4、sphingomonas(鞘脂单胞菌属)、Gp6、Gemmatimonas(芽单胞菌属)、Gp7、Aridibacter(假单胞菌)、Nitrospira(硝化螺菌)、Ferruginibacter(铁锈细菌)、Flavobacterium(黄杆菌)。ZQJWD中Gp4最为丰富,占9.62%,其他占少数;ZQXHMJWD中Gp4和sphingomonas(鞘脂单胞菌属)数量持平,其他占少数;ZQXHM中Gp4数量最多,sphingomonas(鞘脂单胞菌属)稍次之。在三个样品中,细菌数量差异最为明显的是sphingomonas(鞘脂单胞菌属),在ZQXHMJWD和ZQXHM样品中sphingomonas(鞘脂单胞菌属)数量近似,明显多于ZQJWD样品。可能是由于混播条件下的土壤环境受到协同效应影响造成了这种现象。

  图5细菌在属水平上所有样本群落结构分布图

  Fig.5 Distribution of all communities of bacteria at the genus level

  注:图中,横轴为样品名,纵轴为相对丰度比例。颜色对应不同物种,色块宽度表示相对丰度比例。以下类同。

  从图6中可以看到三个样品的真菌种类差异比起细菌要更为明显,能检测到的真菌种类Mortierella(被孢霉属)数量差异最为明显。在ZQJWD中Mortierella(被孢霉属)约占10%;ZQXHMJWD中Mortierella(被孢霉属)占比约为20%;在ZQXHM中Mortierella(被孢霉属)约占30%。

  图6真菌在属水平所有样本群落结构分布图

  Fig.6 Distribution of all communities at the genus level

  本研究发现,土壤微生物的群落优势种差别不大,但含量差别较大,可能是由于同一片试验田里不同样地所采取的不同栽培方式和不同牧草种类综合导致的结果。不同的栽培方式下几种牧草生长过程中对土壤性质产生影响,比如豆科植物的固氮作用,造成土壤微生物生存环境的差异,进而影响土壤微生物的结构及其多样性。

  3讨论

  土壤微生物不仅可以提高作物抗逆性,而且对促进作物养分吸收有显著功效。草地环境是由地下的土壤与地上植物的变化因子分别作用于其土壤微生物群落,从而影响草地土壤微生物多样性[13-14]。由于细菌有自身代谢旺盛、繁殖速度快的特点,所以是根际土壤微生物中种类最多的群体[15],这一点在本文细菌与真菌的相对丰度情况中也有印证。

  通过Darrah等人对植物的根系分泌物的研究发现根系分泌物对根际微生物的群落结构和多样性均有一定的影响[16]。而康林玉等人就土壤微生物对作物生长发育的促进作用的研究发现,原因可能在于土壤微生物的贮存、营养释放和植物根系的协同作用[17]。

  根据刘俊杰等学者对土壤酸杆菌门细菌的研究中显示GP4大量存在于草地土壤环境下,含量大约在8%~20%之间,与土壤pH呈显著正相关[18],本研究所得GP4含量符合该含量区间。鞘氨醇单胞菌对修复受到多环芳烃污染的环境有重要作用,它具有优良的降解多环芳烃的能力[19]。

  混作条件下的土壤环境构成比单播条件下要复杂,在各种因素相互作用下,其根围土壤微生物组成与单播条件下土壤微生物组成有所不同。张瑜等人采用随机区组的试验方法,发现豆禾混播模式具有较好的协同效应,其生产能力在混播处理下显著优于单播处理[20]。