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论文方法写作-水稻bZIP12基因的组织特异性表达活性分析

2021-04-15 08:58:52

  bZIP家族是较多的参与种子的成熟和萌发、花的诱导和光形态建成、压力和对生物和非生物胁迫激素信号和反应发展的基因。目前,通过调查研究发现在水稻基因组中包括许多种不同的bZIP转录因子,而且已经确定其中包含的16个OsbZIP转录因子的基本特征与作用。其往往具有高盐以及耐干旱的能力,另外还和对ABA的敏感性等抗逆性具有密切的关联。本文针对其中一个成员bZIP12基因的组织特异性表达进行活性分析。通过克隆bZIP12启动子序列构建植物表达载体,进一步通过农杆菌介导的转化获得转基因植株,同时利用GUS染色和Real-time PCR检测bZIP12的表达模式。结果表明:与野生型相比,bZIP12启动子在根、茎、叶等部位上有不同程度的表达,其中在根中表达最高。研究明确了bZIP12在不同部位的相对表达量情况,为后续完善bZIP12在ABA介导的干旱途径中以及抽穗期途径中的分子机理研究提供重要理论基础和依据。

  水稻(Oryza sativa L.)为世界各地的大部分人们提供了粮食。水稻是一种众所周知的易受干旱影响的作物,部分原因在于它的小根系统。碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子在植物ABA信号通路中扮演着不可缺少的组分。OsbZIP12为E组bZIP转录因子家族的一位成员,亚细胞定位结果显示OsbZIP12是一个核蛋白,因为有许多非生物胁迫处理的诱导[9]使该基因在植物幼苗地上部和根系的表达为缺氧、盐、干旱等。另有研究表明OsbZIP12是一个不依赖光周期的开花转变抑制因子,参与水稻响应环境可利用水分的变化进而介导开花时间的新通路[10]。为解析OsbZIP12在水稻各组织部位的特异性分布对其参与ABA信号转导及调控抽穗期的功能的影响,本研究一方面探究OsbZIP12启动子的时空特异表达,另一方面在野生型水稻各组织部位检测OsbZIP12的表达情况,旨在揭示OsbZIP12在不同组织的分布是决定其在水稻中发挥不同功能的根本原因,为进一步探究OsbZIP12参与ABA依赖的耐旱性及抑制水稻开花的机理提供理论依据和指导思想,同时也对水稻抗逆性的研究有所帮助。

  位于细胞核内的转录因子(transcription factor,TF)能够对目标基因启动子区域的顺式元件进行明确的交互。所以,调控研究的目的是设计和表达在特定时间和空间具有特定优势的蛋白质分子。转录因子具有转录调控域、DNA结合域、核位置信号和低聚位点。因为具有这些区域使得其具有特殊的功能和性质。DNA结合域的主要作用是控制转录因子对主要元素特异性的识别与结合,在整个过程中具有保守性。正是因为具有该保守性,使转录因子分为许多种类。具有不同功能的转录因子之间的相互作用,实际上指的就是寡核苷酸位点之间的作用。控制转录因子参与转录的模式,使其与DNA结合能力等发生变化。它还可以与蛋白类的转录因子发生相互作用,共同对某一靶基因的转录起调控作用。

  一种来源于bZIP结构域且广泛存在于真核转录因子蛋白中的转录因子,分布很广且保守,称为碱性亮氨酸拉链。在这类研究中,转录水平因子的共同发展是:(1)包含一个由20个碱基和氨基酸组成的碱性蛋白域,负责与特定的DNA片段结合。(2)典型的亮氨酸拉链结构域是3个亮氨酸被6个氨基酸残基所分隔并且第3位和第4位是疏水残基,最后在通过范德华力的作用合成亮氨酸拉链,其二聚能力受到疏水性氨基酸附近极性残基的静电吸引或斥力的影响。(3)除了保守的碱性亮氨酸拉链区域外,bZIP还含有其他相对保守的区域。这些结构域分析可能调节bZIP蛋白的特定属性,如某些结构域也许会在转录中被激活而发挥作用,该结构成为转录激活结构域。(4)在肽链的N端可以以二聚体的形式直接与DNA结合。

  截止到当前为止,在水稻基因组中找到的bZIP转录因子共有89个,均是存在于水稻的染色体中,除此以外,其还是处于不一样的分区中,分布比较乱。

  在1994年,Izawa等人经过研究后明确提出,RITA-1也参与到水稻种子发育期间的水稻基因表达调控中。

  在2001年,路子显等通过对其染色体的分布规律进行深入的研究分析进而发现,部分染色体以及染色体区域会具有一个密度较高的OsbZIP基因。

  在2002年,Haake等人提出,基于ABA的诱导作用下,OsZIP-1a也许会和基因启动子发生结合,进而充分发挥其作用,在“冷”信号传导过程中获得了OsOBF1以及LIP19的参与。

  Dai等分别于2003年以及2004年进行实验研究,最后发现,在部分G-box结合因子的选择失活过程中,OsZIP-2b以及OsZIP-2a发挥着十分关键的作用。在维管束发育过程中,RF2a以及RF2b发挥着十分关键的作用,而且二者在水稻稻瘟病的症状发展过程中发挥着关键的影响作用。

  在2008年,Xiang等经过深入的探索与分析后发现,很多因素都会对于OsbZIP23表达发挥诱导作用,其中包盐碱、干旱以及ABA等。因此,要在低盐以及不耐干旱的水稻中发展OsbZIP23基因,如此一来,就能够有效地增强其抗性,例如抗ABA等。

  在2006年,Mukherjee等人经过研究后提出,在水稻数据库中对100个假定的bZIP序列进行预测,其中,或许会对基于ABA介导的信号转录调控过程进行参与的包括TRAB1以及OSBZ8。

  在2008年,Lu等全面地分析了OsbZIP72的作用,得出结论,即为转OsbZIP72基因的水稻中具有很高的ABA表达水平,不仅如此,也会具有更强的耐旱性。基于对水稻胚的cDNA文库的深入研究与筛选,最后能够获得OSBZ8。

  1材料和方法

  11.1实验材料

  1.1.1水稻材料

  水稻品种松粳2,由中国科学院东北地理与农业生态研究所(哈尔滨园区)提供。

  1.1.2实验菌种与载体

  大肠杆菌感受态Top10,农杆菌菌株EHA105,PBI121-GUS质粒

  1.1.3主要试剂与仪器设备

  DNA限制性内切酶(宝日医生物技术有限公司)、高保真DNA聚合酶PrimerStar(宝日医生物技术有限公司)、DNA胶回收试剂盒购(赛默飞世尔科技公司)、质粒中提试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)、反转录试剂盒PrimeScript(宝日医生物技术有限公司)、

  电泳仪电源(DYY-6C,购自北京六一仪器厂)、微型电泳槽(DYCP-31BN,购自北京六一仪器厂)、PCR仪(S1000,购自美国伯乐BIO-RAD)、立式压力蒸汽灭菌器(BXM-30R,购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)、超净台(SW-CJ-1D,购自苏州净化设备有限公司)、电热鼓风干燥箱(101-DES,购自上海科恒实业发展有限公司)、单列二孔电热恒温水浴锅(DZKW-D-2,购自北京永光明医疗仪器有限公司)、凝胶成像系统(1600,购自上海天能科技有限公司)

  1.2实验方法

  1.2.1 bZIP12引物设计

  利用基因号LOC_Os01g64730在网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)搜索查找bZIP12启动子序列并下载,利用Primer5软件设计特定引物后由库美生物科技(吉林)有限公司合成。引物序列如下:

  bZIP12-F:tctagaCAAGCGACGGCATCCAGTGG引入XbaI酶切位点

  bZIP12-R:ggatccCACCCTCGACGCCATCATCCG引入BamHI酶切位点

  1.2.2 PBI121-bZIP12 pro载体构建

  1.2.2.1 bZIP12启动子序列PCR

  以日本晴的DNA为模板,使用PrimerStar高保真DNA聚合酶和上述引物进行扩增。设定20μl体系如下:

  表1-1 bZIP12启动子序列PCR体系配制

  试剂用量

  DNA模板1μl

  bZIP12-F 0.8μl

  dNTP 1.6μl

  5 X PrimerSTAR HS Buffer 10μl

  PrimerSTAR HS高保真酶0.2μl

  bZIP12-R 0.8μl

  ddH2O 5.6μl

  PCR反应程序如下:

  98℃2 min

  98℃10 s

  65℃10 s

  72℃30 s

  72℃10 min

  1.2.2.2 PBI121载体酶切

  设定酶切反应总体系为20μl,配比如下:

  表1-2 PBI121载体酶切体系配制

  试剂用量

  PBI121质粒10μl

  Cut Smart Buffer 2μl

  XbaI 1μl

  BamHI 1μl

  ddH2O 6μl

  将上述体系混匀后,放置于37℃培养箱2 h左右。

  1.2.2.3载体与片段的回收

  针对经过酶切以后获得的线性化载体以及PCR扩增产物实施琼脂糖凝胶电泳操作,在此基础上回收胶块,方法如下:

  (1)切取条带正确且清晰的胶块到1.5 ml离心管中,加入300μl的binding buffer,在55℃下水浴10分钟左右。

  (2)在胶块完全溶解的离心管中加入2.5μl硅胶,在55℃金属中溶解10分钟。

  (3)12000 rpm,离心1分钟,弃掉上清液后加入600μl的wash buffer,漩涡震荡,重复2次。

  (4)晾干沉淀,加10μl ddH2O漩涡震荡,55℃溶解5 min。

  (5)12000 rpm,1 min离心后吸取上清液,即为回收产物。

  1.2.2.4载体的连接

  测定回收产物的浓度,依据浓度计算添加量,配制如下连接体系:

  表1-3连接体系的配制

  试剂用量

  PBI121线性化质粒3μl

  bZIP12pro PCR回收产物2μl

  T4连接酶1μl

  T4连接酶Buffer 1μl

  ddH2O 3μl

  1.2.2.5连接产物转化大肠杆菌

  (1)取Top10感受态,放置冰上直至融化,向其中加入连接产物,在冰上放置30 min,后转到42℃水浴中热激90 s,取出后冰浴2 min,最后在超净工作台中加入800μl无菌的无抗LB培养基。

  (2)37℃摇床低转速150 rpm培养1 h。

  (3)从摇床中取出后12000 rpm,1 min离心,弃掉上清液收集沉淀的菌体,在超净工作台中涂抹在含有Kana抗生素的固体培养基上,放于37℃培养箱中过夜培养。

  1.2.2.6阳性克隆的鉴定

  在过夜培养的培养基上挑选单克隆进行PCR鉴定,设定反应体系如下:

  表1-4菌落PCR体系配制

  试剂用量

  HiFi BufferⅠ1.0μl

  GC Enhancer 0.5μl

  dNTP 0.8μl

  PBI121-F/R各0.4μl

  HiFi DNA聚合酶0.1μl

  ddH2O 6.9μl

  菌落0.3μl

  PCR程序如下:

  94℃5 min

  94℃30 s

  58℃30 s

  72℃40 s

  72℃10 min

  琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,通过片段大小判断载体是否构建成功。

  1.2.2.7 PBI121-bZIP12 pro重组质粒转化农杆菌感受态EHA105

  (1)向EHA105感受态中加入重组质粒,在冰中放置10 min中,取出后投入液氮中悬浮5 min,37℃水浴5 min,加入800μl无菌的的无抗LB培养基。

  (2)28℃摇床低转速150 rpm培养2-3 h。

  (3)12000 rpm,1 min离心后弃掉上清液,收集沉淀的菌体,在超净工作台中均匀涂抹在含有Kana+Rif抗生素的固体培养基上,在28℃培养箱中培养48 h。

  1.2.3水稻诱导愈伤

  将农杆菌转化获得的产物交由专门的组培人员,农杆菌介导转化筛选获得抗性愈伤分化获得水稻转基因苗。

  1.2.4转基因水稻阳性苗的鉴定

  (1)DNA的粗提:取材:向2 mL离心管中加入一颗小钢珠,取适当的水稻叶片加入离心管,标清编号;磨样:将装有叶片的2 mL离心管伸入液氮中数秒后取出将叶片打碎,倒出小钢珠;提取:加入300μl的DNA提取液,剧烈振荡混匀,65℃水浴30 min,而后加入300μl的氯仿,振荡混匀,12000 rpm离心10 min以后取上清于新的离心管,接下来,再将具有相同体积的异丙醇加入其中,将其颠倒混合均匀以后静置10 min。12000 rpm,10 min离心操作以后将上清扔掉,晾干后加入30μl的无菌水。

  (2)PCR检测:用所转化载体上筛选标记潮霉素基因的引物扩増,能够扩増出来的即为阳性苗。

  表1-5 PCR检测体系配制

  试剂用量

  DNA模板1μl

  Taq酶

  5μl

  引物F/R各0.4μl

  ddH2O 3.2μl

  PCR程序如下:

  95℃5min

  95℃30s

  65℃30s

  72℃40s

  72℃10min

  (3)琼脂糖凝胶电泳:选择使用1 g的琼脂糖,将其放置到锥形瓶中,加入100 ml 1×TAE电泳缓冲液,接下来,将其充分发挥微波炉的作用,对其实施加热操作,直到煮沸,使得琼脂糖彻底融化,将其放置,等到冷却到60℃时,加入7μl的EB溶液,充分摇匀后倒胶。待琼脂糖凝胶完全凝固后,将其放入电泳槽中,加入1×TAE电泳缓冲液直至液面完全覆盖过凝胶的表面,取PCR产物5μl,点样。盖好电泳仪的盖子,接通电源,设置电压为120 V,电泳时间约15 min。电泳结束后,将琼脂糖凝胶在紫外凝胶成像仪中观察,记录结果。

  1.3转基因植株T1代GUS染色

  (1)取T1代转基因植株的根、茎、叶、穗、种子、叶枕和叶节,放入2 ml离心管中。

  (2)向离心管中加入GUS染色溶液(配方见表1-6)浸没材料,在37℃恒温箱中放置12 h。

  (3)首先,取出GUS染色液,接下来,将2 ml、浓度为75%乙醇加入其中,在37℃恒温箱中实施12h的脱色处理,在此过程中更换2-3次浓度为75%乙醇,在材料叶绿素脱色彻底以后再停止操作。

  (4)充分发挥体视显微镜成相系统的作用,对材料GUS染色结果进行严密的观察,并且要拍照保存下来。

  1.3.1母液的配置

  (1)0.1M PBS(PH7.0)100 ml

  KH2PO4(136.09)0.566 g

  K2HPO4·3H2O(228.22)1.333 g

  放入以上试剂后,溶液PH为6.8。温度为20℃。

  (2)K-Fe-Nc母液(5 mM)100 ml

  铁氰化钾(329.3)0.165 g(红色结晶,吸水,放入水中变成黄色溶液)

  亚铁氰化钾(422.4)0.211 g(淡黄色结晶,两者都易溶于水,需要避光保存)

  (3)X-Gluc(20 mg/ml)1 ml

  X-GlcA(C14H13BrCINO·C6H13N(521.8))20 mg

  加入1 ml的N,N-二甲基甲酰胺,混合至完全溶解。比较容易溶解。

  1.3.2工作液的配置

  表1-6 GUS染液配方

  试剂配制30 ml所需母液量

  0.1MPBS(pH7.0)15 ml

  K-Fe-Nc母液3 ml

  Triton X-100 0.03 ml

  甲醇100%6 ml

  X-Gluc母液0.9 ml

  dd H2O 5.4 ml

  最终液体为黄色透明溶液。可以反复使用,用锡箔纸包住,-20℃保存。

  1.4水稻中bZIP12组织特异性表达分析

  1.4.1植物总RNA的提取

  利用康为的超纯RNA提取试剂盒来提取总的RNA,方法如下:

  (1)在研钵中加入少许液氨冷却后,加入新鲜的水稻叶片,再次加入少许液氮并快速研磨为粉末状。

  (2)将上述粉末移入RNase-Free离心管中,将1 ml的TRIzon Reagent加入其中,并且在冰上放置5 min。

  (3)往离心管中加入200μl的氯仿,涡旋振荡15 s后室温放置2 min。

  (4)4℃12000 rpm,10 min离心,取上层的水相移入新的RNase-Free离心管中。

  (5)在离心管中加入具有相同等体积的、浓度为70%的乙醇,其是通过无RNase水配制而成的,将其混合均匀混匀。

  (6)在已经装入收集管的吸附柱中加入以上步骤中获得的所有溶液。若无法一次性地将所有溶液加完,那么就能够分成几次转入。4℃12000 rpm,20 s离心,将收集管中的废液倒掉后重新将吸附柱放入收集管中。

  (7)在吸附柱中加入700μl的Buffer RW1,4℃12000 rpm,20 s离心,并且倒掉收集管中的废液,然后,再把吸附柱置入收集管中。

  (8)在吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇),4℃12000 rpm,20 s离心,倒掉收集管中的废液,然后,再把吸附柱置入收集管中。

  (9)对上一步(8)的操作进行重复。

  (10)4℃12000 rpm,2 min离心,倒掉收集管中的废液,然后,再把吸附柱放置于超净工作台中,彻底晾干。

  (11)取一个新的无RNase离心管,将吸附柱放入其中,接下来,将30μl的RNase-Free Water加入吸附柱的中间位置,在室温的条件下放置1min,4℃12000 rpm,1 min离心,对离心管中的RNA溶液进行收集,并且对其浓度进行检测,放置在-80℃的温度下进行保存。

  1.4.2 cDNA的获得

  以上述提取总RNA为模板,使用反转录试剂盒来进行反转录:

  (1)将反应液在离心管中配置,体系如下:

  表1-7反转录反应液的配制

  试剂用量

  Total RNA 3μl

  5×gDNA Eraser Buffer 2μl

  gDNA Eraser 4μl

  RNase Free dH2O 1μl

  (2)将反应液充分混匀后,进行PCR,程序为42℃,2 min,待取出样品后瞬时离心后放置于冰上。

  (3)配制反转录反应体系:

  表1-8反转录反应体系的配制

  试剂用量

  第一步RNA变性液10μl

  PrimeScript RT En2yme Mix 1 1μl

  RT Primer Mix 1μl

  5×PrimeScript Buffer 2 4μl

  RNase Free dH2O 4μl

  (4)反转录所需的程序为:37℃,15 min;85℃,30 s;4℃终止反应。

  1.4.3 Real-time PCR

  取稀释一定倍数的的反转录cDNA为模板,然后按表1-9在冰上配制PCR反应液。将上述混合液混匀后转移到八连管中,盖好盖子。使用低速离心机短时间离心后将八连管放入实时定量PCR仪中,按照设定好的程序运行。

  表1-9荧光定量反应液的配制

  试剂使用量

  SYBR Premix Ex TaqⅡ7.5μl

  PCR Forward Primer(10μM)0.5μl

  PCR Reverse Primer(10μM)0.5μl

  灭菌水5.5μl

  DNA模板1.0μl

  2结果与分析

  2.1 PBI121-bZIP12 pro表达载体的构建

  利用Primer STAR HS高保真酶扩增获得bZIP12启动子序列2036 bp(图3-1 A),回收PCR产物及双酶切线性化载体PBI121,测定酶切后的载体浓度后设定连接的体系,将连接产物转入大肠杆菌感受态中后获得融合基因,对转化得到的单菌落进行PCR鉴定,将菌落PCR鉴定得到的正确菌株进一步提取质粒,双酶切鉴定该质粒,鉴定结果如图3-1 B所示,最后获得的重组质粒中含有报告基因。

  图3-1 PBI121-bZIP12 pro表达载体的构建电泳图

  注:M为MarkerAL2000,图A为bZIP12 pro的PCR电泳条带,图B为PBI121-bZIP12 pro重组质粒酶切结果,1-4是4个不同的单菌落获得的质粒。

  2.2转化基因和分子鉴定转基因植株

  将构建完成的重组质粒转化农杆菌EHA105,转基因植株的获得由组培团队协助完成,简言之,野生型松粳2水稻种子诱导愈伤,愈伤组织的农杆菌侵染,经除菌、共培养、筛选等一系列操作,最终经分化得到了转基因植株(图3-2)。提取前面所培养的转基因植株的DNA,利用潮霉素进行标记的PCR鉴定,鉴定出多株阳性植株(图3-3)。

  图3-2转基因植株的获得

  注:图A为水稻种子诱导的愈伤组织;图B为用于侵染的愈伤组织,图C为抗性愈伤组织的筛选,图D-G为转基因植株的分化

  图3-3转基因植株的PCR鉴定

  注:M为MarkerAL2000,泳道1-10为转基因植株,11为野生型对照。

  2.3转基因植株的GUS组织活性染色

  为了研究bZIP12基因的表达组织特异性,我们采用研究该基因启动子的表达特性的方法。选取T1代转基因成熟植株,于同一时期取整株的不同组织部位进行GUS组织活性染色检测,同时以野生型植株作为对照。用浓度不同的酒精进行脱色处理,然后用显微镜观察其表达的情况,最后用实体显微镜拍照记录。结果如图3-4 A所示,转基因水稻的GUS活性在水稻植株中呈现不同程度的表达,在根中检测到蓝色沉积最为显著,即bZIP12基因启动子驱动GUS报告基因在根中表达量最高,其次在叶片以及叶枕中同时检测到GUS报告基因的表达,且在叶枕部位蓝色沉积更加多一些。有趣的是bZIP12基因在主茎干中没有表达而在茎节中检测到GUS信号,由于bZIP12通过ABA途径参与水稻耐旱性,则判断它在茎部的表达特性可能与物质运输相关。此外,在生殖生长期检测到该基因在水稻幼穗的外稃中表达而在花药中没有表达,而到灌浆完成获得的成熟种子中却没有检测到该基因的表达,该结果表明bZIP12基因启动子驱动的基因表达具有时空特异性。而作为对照的野生型植株在任何时期任何部位都检测不到GUS活性(图3-4B)。

  图3-4 bZIP12-pro驱动GUS基因在水稻中的表达

  2.4 Real-time PCR分析

  在已有定性研究表达量基础,为了量化bZIP12基因的表达组织特异性,选取野生型松粳2植株,提取不同生长状态的RNA,利用Real-time PCR对bZIP12基因在不同组织部位中的表达情况进行分析。鉴定结果如图3-5所示,可以看出与GUS组织活性染色的结果相同,但该基因在不同部位中的表达量不同,如在根中最高,叶片中较低,在茎部、幼穗、成熟穗以及种子中表达量则均不高。值得注意的是,由于穗部在取样过程中并没有细分为外稃、花药等部位,而茎部在取样时也没有分主茎干与茎节,因而定量结果与染色结果理论上是一致并且准确的。

  图3-5 bZIP12 Real-time PCR

  3讨论

  目前,通过研究植物启动子来探究基因表达与应用的成果颇多。基因启动子的瞬时表达分析和缺失突变分析可以通过转化系统进行,然后通过对启动子区各个顺式作用元件功能的验证,在此基础上获得有着特定表达调控的很多不同种类的启动子。深入的去研究这些调控启动子,一方面有利于对我们在植物细胞生长发育发展过程中了解启动子的具体调控表达机制,进一步解析其所驱动基因参与的代谢途径,完善水稻生长过程中基因调控的关系网络,另一方面利用获得的这些随时空变化呈现出不同的表达调控模式的启动子,在生产实践中,对培育稳定遗传的抗除草剂、抗逆性强、抗虫抗病、抗倒伏、耐冷性强、提高水稻品质等有经济利益的高产高价值蛋白表达特性等具有重要理论指导意义。

  3.1基因启动子的生物信息学分析

  众所周知,在基因发挥功能过程中,启动子扮演着重要的角色,同时在启动子序列中所存在的多种顺式作用元件,肩负着控制基因表达及响应环境逆境的重要职责。已有研究表明启动子序列分析中可预测到有很多与环境应答相关。例如,在拟南芥根中CKX3的特异表达是由拟南芥PYK10启动子调控的,转基因植株的主根会在一定程度上发生伸长,而且,会增加根的生物量以及根系,然而,并不会影响到地上部分,如此一来,就能够有效地增强矿物质的吸收能力与植物的抗旱能力[11]。本研究中bZIP12基因驱动GUS报告基因在根中大量表达,而水稻的根系在水稻的整个生命周期中具有无可替代的作用,根深叶茂才可能高产,bZIP12在根系中的大量表达也暗示着其存在着不可或缺的功能。

  3.2基因启动子的研究方法

  为了深入了解某一基因在植物体内的表达特性,研究人员可以连接报告基因进行定性或定量的分析在启动子驱动下的表达情况。启动子的表达模式通常通过随后外源性基因的表达来分析和验证。报告基因是后期基因,极易会对表达水平进行控制与管理。极易会检测获得报告基因的表达产物,受体细胞中不应存在类似的内源性表达产物。LUC、CAT、GFP、GUS与RFP等报告基因是目前研究中所使用较多的。在需要对启动子的表达方式进行分析时,GUS则是在众多报告基因中应用较多的。在本实验中,对bZIP12基因的时空表达特性采用GUS组织活性染色检测,然而由于启动子序列预测准确性、GUS染色的检测灵敏度等原因,对于启动子的研究仍存在局限性,未来可以通过设计不同截断区段深入探究该启动子功能区域。

  3.3基因启动子与环境逆境应答关系探究

  抗逆性强一直是育种家选育水稻新品种的基本要求,而对于水稻应对非生物逆境的研究层出不穷,有较多的转录因子有参与该研究,同时为了应对环境胁迫转录因子可通过与启动子中一些特异的位点结合的方式来增强或降低转录活性,由此,研究启动子的缺失显得十分重要。由于bZIP12通过ABA途径参与水稻耐旱性,推测在其启动子区域可能存在ABA相关结合元件,然后利用所获得的转基因新植株进一步进行耐旱性的研究,有利于对bZIP12发挥耐旱性的分子机理奠定理论基础和对其所参与的调控网络进行确认提供了参考。