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论文写作模式-构建酿酒酵母细胞工厂生产八氢番茄红素

2021-05-12 12:44:26

  八氢番茄红素是一种无色的脂溶性类胡萝卜素,具有抗氧化、抗癌症、消炎等功能,广泛应用于食品、化妆品、医药等行业。本文运用重叠延伸PCR和连接酶链反应(LCR),构建trp臂-crtB整合片段,整合进底盘酿酒酵母菌株,得到一株酿酒酵母菌Sc01P01,有生产八氢番茄红素的基本能力。进一步,将LEU臂_tHMG1-TmCrtE片段,同源重组整合进酿酒酵母菌Sc01P01,最终得到了一株能高产八氢番茄红素的酵母菌Sc01P02,产量高达,提高了倍。

  八氢番茄红素(Phytoene)为天然脂溶性类胡萝卜素,其它的分子式为C40H64,相对分子质量为544,属碳氢化合物,也是四萜类化合物。它由9个不饱和双键组成的长链烃,含3个共轭不饱和双键。八氢番茄红素不能溶解于水中,但可溶于有机溶剂,如氯仿、苯、石油醚等。15-顺式八氢番茄红素和全反式八氢番茄红素是八氢番茄红素的主要异构体,且全反式八氢番茄红素的热稳定性优于全反式结构(如图1.1所示)[1]。

  图1.1全反式-八氢番茄红素的结构式

  八氢番茄红素的共轭体系与其吸光性、抗氧化活性有关。由于只有3个共轭双键数,八氢番茄红素肉眼可见为无色,所以只在紫外光区有吸收,且它的最大吸收波长λmax为276、287、297nm(溶剂:石油醚)[2],此特性可用于检测八氢番茄红素。还能与过氧化物自由基发生不可逆反应,以达到清除自由基的作用,而产生抗氧化活性。但由于八氢番茄红素的双键活性较强,八氢番茄红素在光、热条件下构型不稳定,易产生氧化反应,所以在提取八氢番茄红素时可加入2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)等抗氧化剂避免[3]。

  1.2八氢番茄红素的功能

  主要由植物和微生物合成的脂溶性色素——类胡萝卜素,是一种萜类化合物,具有药用价值及市场价值,八氢番茄红素作为无色类胡萝卜素属,据调查,也具有抗氧化、抗癌症、抗炎症、光保护等作用。

  (1)抗氧化。类胡萝卜素的抗氧化特性,是与清除自由基活性及其独特的单线态氧猝灭能力有关。生物体内的自由基能引起DNA构象发生变化而破坏遗传物质的稳定性,造成衰老。所以八氢番茄红素主要是在低氧条件下,可以与过氧化物自由基形成加合物,阻止自由基链锁反应,从而清除过氧化物自由基产生抗氧化作用[4]。

  (2)抗癌。类胡萝卜素也可以影响多种信号通路,基于流行病学研究表明,当八氢番茄素等类胡萝卜素和其他化合物(如维生素E)的联合使用时,能协同抑制雄激素受体活性,以抑制前列腺癌细胞的生长[5]。但另有研究表明,仅八氢番茄红素并不能影响前列腺癌细胞的生长[6]。

  (3)抗炎。无色类胡萝卜素也可被用于消炎辅助药物。辅酶Q10和类胡萝卜素或辅酶Q10和八氢番茄红素的组合物,能使成纤维细胞在紫外线或白细胞介素-1作用下,增加产生几种内源性介质,使炎症介质活性大大降低,增强免疫反应[1]。

  (4)光保护。类胡萝卜素也可以是一种光保护剂,当紫外线照射皮肤时,被认为发生光氧化反应,适当补充类胡萝卜素以清除单线态分子氧或过氧自由基,可改善紫外线诱导的红斑,而起到保护皮肤的作用。研究表明,与单一的番茄红素相比,摄入加入八氢番茄红素、六氢番茄红素及番茄红素的混合物,能更好地防护紫外线[7]。

  1.3八氢番茄红素的生产方法

  现如今已知的八氢番茄红素的生产方法主要有三种。而植物提取法是主要从番茄等植物中提取,存在提取成本高、产品纯度低、依赖自然资源、难以工业化等缺点。化学合成法有着产物纯度低,环境污染、安全性低等缺点。最有效的方法是生物合成法,由微生物发酵生产,具有成本低、效益高、环境友好、安全性高等优点。以下主要介绍八氢番茄红素的生物合成法。

  八氢番茄红素作为无色类胡萝卜素属,也是一种萜类化合物,主要经类异戊二烯途径来生物合成。目前认为八氢番茄红素的代谢路径,经由2-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径或甲羟戊酸(MAV)途径(如图1.2所示),合成萜类的2个C5前体单元异戊二烯焦磷酸(IPP)和甲叉双丙烯焦磷酸(DMAPP),然后在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(crtE基因编码)的催化下DMAPP与三分子IPP缩合成C20的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP);最后,2个GGPP分子在八氢番茄红素合成酶(crtB)的催化下合成C40的八氢番茄红素[8]。其中,MEP途径主要存在于藻类和细菌中,MAV途径主要存在于真菌和古细菌中。

  图1.2八氢番茄红素代谢路径

  本文以酿酒酵母为宿主,引入来源于成团泛菌(Pantoea agglomerans,Pa)的crtB基因,crtB基因编码八氢番茄红素合酶,插入此基因使菌株获得基本生产八氢番茄红素。然后在此基础上,引入来源于曼地亚红豆杉(Taxus x media,Tm)的crtE基因和截断的酿酒酵母内源HMGR的tHMG1基因,其中tHMG1删除了感知固醇组分的膜结合域,是HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A)向MAV转化中的关键限速酶,上调tHMG1能提高MAV路径通量[9],crtE基因则是编码牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶。本文通过调节crtE和tHMG1基因的表达,来促使酿酒酵母高效合成八氢番茄红素。

  1.4用微生物代谢生产八氢番茄红素的研究现状

  不同于化学合成法或植物提取法,生物合成法具有具有经济性好、可持续、环境友好、安全等优点。因八氢番茄红素其无色性及光保护性,在化妆品等行业备受瞩目。所以,用微生物发酵生产八氢番茄红素的研究于近几年兴起。

  2017年,Pollmann等人[10]开发了一株Xanthophyllomyces dendrorhous AXG-13(虾青素高产突变体)来发酵生产八氢番茄红素。首先,通过插入潮霉素抗性基因来破坏crtI基因表达,用定向诱变的方法得到高产八氢番茄红素的X.dendrorhous突变体。然后过度表达编码限速酶的HMGR、crtE和crt YB基因,来提高代谢路径的前体供应。最终,经小规模发酵,该菌株能稳定生产10.4 mg/g DCW的八氢番茄红素。而Srinivasan等人[11]则是开发了一种海洋微藻,即杜氏盐藻(Dunaliella salina)。通过RNAi和反义技术,下调八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的表达,来达到在杜氏盐藻V-101中积累八氢番茄红素的目的,其中由RNAi构建的菌株生产八氢番茄红素的产量高达108.34±22.34μg/100mg DCW。2018年,Fuke等人[12]在嗜热古细菌(Thermococcus kodakarensis)引入Saci_1734基因(八氢番茄红素合酶同系物),使T.kodakarensis能够生产八氢番茄红素。通过双重表达Saci_1734基因并敲除ACS I基因的方法能使该菌株生产八氢番茄红素的能力提高3.4倍。Jeong等人[13]以耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)为底盘细胞,通过外源基因的过度表达,来提高细胞产量。先敲除crtI基因,然后上调crtB基因和DXS基因的表达,提高MEP路径中前体单元的供应,最终该菌株能生产10.3±0.85 mg/l的八氢番茄红素。2019年,Laje等人[14]利用色素抑制除草剂来抑制八氢脱氢酶(PSD)的活性,使新型绿色微藻Chlorococcum sp.(UTEX B 3056)能够急剧积累八氢番茄红素,并检测到约33 ug/mg DCW的八氢番茄红素,而在对照组中无法检测到八氢番茄红素。

  尽管目前关于异源合成番茄红素和β-胡萝卜素的研究报道诸多,且纯度较高,而八氢番茄红素为类胡萝卜素的前体物质,缺乏高水平的基因操作工具,所以通过微生物的代谢工程改造来提高八氢番茄红素的产量具有一定困难。目前已有利用细菌、古细菌、真菌、微藻为宿主生产八氢番茄红素的研究,但离达到工业化水平还远远不够。

  1.5酿酒酵母异源合成八氢番茄红素的前景

  酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)又称面包酵母或者出芽酵母,是单细胞真核微生物,是迄今为止了解最充分的真核生物,于1996年完成了全基因测序,上千个基因被分析[15]。酿酒酵母至今已有数千年的使用历史,最早用于酿酒、面包产业。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形,直径5-10μm。其繁殖的方法为出芽生殖。酿酒酵母被认为是GRAS生物[16],遗传背景清晰,易进行遗传操作,且在酿酒酵母中存在高效合成萜类的MAV途径,乙酰辅酶A经多步反应,并将外源基因导入可高效合成八氢番茄红素(如图3所示)。随着生物工程的兴起,人们开始利用以酿酒酵母为宿主表达外源基因产物,如脂肪酸[18]、人参皂苷[17]、丹参酮[19]、番茄红素[20、21]等物质。所以,酿酒酵母作为一种理想型的细胞工厂,有着高产脂溶性八氢番茄红素的潜力。

  自1981年,人们开始用酿酒酵母作宿主表达外源基因,其表达系统具有很多优点,酿酒酵母的遗传背景清晰,其全基因序列约1.2 x 107 bp,共有16条染色体,约6000个ORF,仅4%基因含有内含子;易培养,生长繁殖迅速,工艺简单,可大规模生产,能有效降低成本,现已广泛应用于酿酒和食品等领域,且不会产生内毒素,安全性;外源基因表达时对蛋白质具有一定的翻译加工能力,使外源蛋白具有一定的折叠加工和糖基化修饰,因此相对其他表达系统,酵母表达的蛋白具有高生物活性及稳定性;且菌体的维生素、蛋白质多,大规模发酵时菌体不易被噬菌体吞噬。

  并且在酿酒酵母中,存在高效合成萜类化合物且唯一的MAV途径。以乙酰辅酶A为底物,经一系列的酶催化,包括乙酰乙酰辅酶A硫解酶(ERG10)、β-羟基-β-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶(ERG13)、HMG-CoA还原酶(HMGR)、MVA激酶(ERG12)、MVA磷酸激酶(ERG8)、MVA二磷酸脱羧酶(ERG19)、IPP异构酶(IDI1)等,最终合成萜类基本单元IPP和DMAPP。然后IPP和DMAPP在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(crtE)催化下生产牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)。最后,2个GGPP分子在八氢番茄红素合成酶(crtB)的催化下合成八氢番茄红素,此后经相应酶催化可生成其他类胡萝卜素。

  其中,以酿酒酵母菌为宿主细胞异源表达的类胡萝卜素中最普遍的是番茄红素。施明雨等人研究表明,在酿酒酵母中插入CrtB和CrtI基因,然后通过优化代谢路径,上调tHMG1基因、BTS1-ERG20融合基因和SaGGPS基因的表达,可将番茄红素产量提高77.0倍[20]。其次,有以酿酒酵母为宿主细胞表达β-胡萝卜素,在高书良等人的研究中,利用DNA组装技术,向宿主插入CrtE,CrtYB和CrtI基因,使其能够产生3.68 mg/g DCW的β-胡萝卜素[22]。还有以酿酒酵母为宿主细胞表达虾青素的研究报道,在王瑞钊等人的研究中,通过改造菌株,筛选得到生产虾青素前体产量最高的菌株,整合羟化酶(CrtZ)和酮化酶(CrtW)的不同组合,最终得到虾青素产量为4.4 mg/g DCW的的酵母菌[23]。

  通过上述的研究可说明,用酿酒酵母异源表达类胡萝卜素—八氢番茄红素的可行性强、可操作性高。

  1.6本文的研究意义和主要内容

  八氢番茄红素属于无色类胡萝卜素,也具有抗氧化、抗癌症、抗炎症、光保护等作用。,在食品添加剂、医药、化妆品生物燃料等行业的应用受到人们越来越多的关注。本文以酿酒酵母为底盘细胞,插入PacrtB基因,使菌株具备产八氢番茄红素的能力;过表达tHMG1和TmCrtE基因,优化代谢路径,提高八氢番茄红素通量,来构建高效合成八氢番茄红素的酿酒酵母细胞工厂。

  本课题研究的主要内容如下。

  1、通过overlap PCR得到CrtB片段,连接转化,验证得到TRP臂_PacrtB质粒,酶切得到TRP臂_PaCrtB片段,酵母转化整合进底盘酿酒酵母菌中,验证得到重组酵母菌Sc01P01。

  2、用LEU臂_tHMG1-TmCrtE质粒,PCR扩增得到LEU臂_tHMG1-TmCrtE片段,酵母转化整合进重组酵母菌Sc01P01,验证得到重组酵母菌Sc01P02。

  3、将重组酵母菌Sc01P01和重组酵母菌Sc01P02进行发酵生产,发酵产物用高效液相色谱HPLC在检测波长287nm下检测,比较两种菌株产八氢番茄红素的能力。

  2实验材料及方法

  2.1实验材料

  2.1.1菌株、质粒和引物

  本次研究所用菌株、质粒和引物列于下表2.1、2.2、2.3。

  表2.1本文所用的菌株

  菌种名描述来源

  SyBE_Sc14C10 CEN.PK2-1C,Δgal1Δgal7Δgal10::HIS3,Δypl062w::KanMX实验室保存

  Sc01P01 SyBE_Sc14C10,

  trp1::TRP1_PGAL1-PaCrtB-TPGK1本研究

  Sc01P02 SyBE_Sc14C10,

  trp1::TRP1_PGAL1-PaCrtB-TPGK1,leu2::LEU2_TACT1-tHMG1-PGAL10-PGAL1-TmCrtE-TGPM1本研究

  表2.2本文所用的质粒

  质粒名描述来源

  Ec01004 Trp臂实验室保存

  LEU臂_tHMG1-TmCrtE表达盒实验室保存

  Ec01058 TRP臂_PacrtB表达盒本研究

  表2.3本文所用的引物

  引物名序列(5’—3’)

  ScGAL1P_F_HindIII

  ATGGCTTATACCGCAATGG

  TTAGTTTTGCCTGAAAGCG

  ACCTGGTGTAGACATTGCGA

  TGTAATATGGTTCGGCTGCA

  CAGATGGCAGTAGTGGAAGATATT

  GGCTCTCTTGCCTTCCAAC

  ScPGK1t_R_XhoI

  scLEU_LF

  scLEU_RR

  LEU_F1

  TmE_F

  TmE_R

  SccrtB_vF

  SccrtB_vR

  ScTRP_vF

  ScTRP_vR

  ScTPR_LF

  ScTRP_RR

  2.1.2实验仪器

  本文所需的主要实验仪器如表2.4所示。

  表2.4本文所用的主要实验仪器

  仪器型号生产商

  梯度PCR仪

  电泳仪

  冷冻离心机

  微型离心机

  超净工作台

  准微量天平

  电热恒温水浴锅

  生化培养箱

  台式恒温振荡器

  超低温冰箱

  冰箱

  超纯水系统

  制冰机

  立式压力蒸汽灭菌锅

  移液枪

  电热恒温培养箱

  数显型双加热块干浴

  涡旋仪

  电泳仪

  高效液相色谱仪(HPLC)A300

  DYY-6C

  MICRO17R

  Mini-7K

  ZHJH-C1209B

  BT125D

  DK-S24

  SPX-70BII

  IS-RDD3

  FORMA991

  BCD-642WD

  Direct-Q5 UV-R

  IMS-20

  LDZX-50KBS

  Eppendorf

  DHP-9162

  Dry Block Heater 2

  Vortex Genie 2

  PHS-3C

  Applied Biosystems

  北京六一生物科技有限公司

  赛默飞世尔科技有限公司

  南北仪器有限公司

  上海智城分析仪器制造有限公司

  北京先驱威锋技术开发公司

  三发科学仪器有限公司

  广州沪瑞明仪器有限公司

  上海五久自动化设备有限公司

  赛默飞世尔科技有限公司

  青岛海尔股份有限公司

  北京联合科力科技有限公司

  常熟市雪科电器有限公司

  上海申安医疗器械厂

  德州曼巴商贸有限公司

  太仓市华利达实验设备有限公司

  上海昀冠机电设备有限公司

  Scientific Industries,USA

  上海仪电科学仪器股份有限公司

  2.1.3主要试剂

  本研究所用的主要试剂如表2.5所示。

  表2.5本研究所用的主要试剂

  试剂生产商

  质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA纯化试剂盒

  蛋白胨、酵母粉

  葡萄糖、D-(+)-半乳糖、琼脂粉、氨苄青霉素、氯化钠、无水氯化钙、醋酸锂

  冰醋酸、乙二胺四乙酸二钠、乙酸钠、无水乙醇

  ssDNA、PEG3350、核酸染料、NaOH、DMSO、SDS

  琼脂糖

  DNA提取液=25:24:1(酚氯仿)

  FastTaq DNA聚合酶、DNA Marker、dNTP

  Q5高保真DNA聚合酶,SacI、ApaI、HindIII、XhoI限制性内切酶

  T4DNA连接酶

  Trizma base天根生化科技(北京)有限公司

  OXOID

  生工生物工程(上海)股份有限公司

  国药集团化学试剂有限公司

  北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司

  GENVIEW

  Solarbio

  TransGen Biotech

  New England Biolabs

  Ferment as

  VETEC

  2.1.4培养基

  LB培养基配方:10 g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L氯化钠、水1L,分装每个三角瓶100mL。配制固体培养基,每个瓶中再加1.5g琼脂粉。(如需加入氨苄青霉素进行筛选,应将灭菌后的培养基冷却至~60℃,加入100μlAMP母液,使浓度达到100μg/mL。)

  YPD培养基配方:20 g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、水1L,分装每个三角瓶100mL。配制固体培养基,每个瓶中再加2.0g琼脂粉。

  营养缺陷型培养基配方:20 g/L葡萄糖、6.7g/L酵母氮源、2g/L混合氨基酸粉末(缺少URA、TRP、HIS、LEU)、水1L。调节pH至6.5,分装每个三角瓶100mL,配制固体培养基,每个瓶中再加2.0g琼脂粉。临用前再向瓶中加入对应的氨基酸母液(100x)。

  试管YPD种子培养基:20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉、50 mg/L尿嘧啶、20 mg/L His。

  摇瓶YPD种子培养基:20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉、50 mg/L尿嘧啶、20 mg/L His。

  YPDG发酵培养基:20或40 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母粉、20 mg/L尿嘧啶、20 mg/L His,10 g/L D-(+)-半乳糖。

  灭菌:高压蒸汽灭菌121℃,20min。

  2.1.5溶液

  50×TAE:称取242gTris碱及18.622g EDTA(PH=8.0),量取57.1mL冰醋酸,充分溶解后用去离子水定容至1L。使用时需稀释成1×TAE作电泳缓冲液。

  氨苄青霉素母液(100mg/ml):称量5g氨苄青霉素置于50mL离心管中,先加入40mL无菌水充分溶解,定容至50mL,用0.22μm滤膜过滤除菌后分装、保存备用。

  D-(+)-半乳糖母液(100g/l):称量5g D-(+)-半乳糖溶于50ml无菌水中。

  葡萄糖母液(400g/l):称取20g葡萄糖溶于50ml无菌水中。

  D-(+)-半乳糖、葡萄糖母液灭菌:高压蒸汽灭菌121℃,15min。

  2.1.6琼脂糖凝胶的制备

  用不同大小的梳子可制备不同孔径的凝胶。称取1g琼脂糖于100ml 1xTAE缓冲液,加热4~6次,充分溶解,室温下冷却至50~60℃,倒入胶槽中,插上梳子,静置凝固。充分冷却凝固后,竖直向上拔掉梳子,把胶放入槽中,准备跑胶。

  2.2实验方法

  2.2.1构建TRP臂-PaCrtB质粒

  本文先通过PCR扩增获得酵母启动子、终止子、基因等片段。然后运用重叠延伸PCR技术(Overlap Extention PCR)将上述DNA片段进行组装,将组装后的DNA片段与含trp臂的载体连接,构建重组质粒。DNA模块如下图2.1所示。

  图2.1 DNA模块图

  2.2.1.1扩增片段

  (1)PCR扩增

  本文采用Q5高保真DNA聚合酶进行PCR扩增启动子(GAL1p)、基因(PaCrtB)、终止子片段(PGK1t)。配制PCR体系如表2.6所示,设置反应程序如表2.7所示。

  表2.6高保真PCR体系组成(Q5)

  ddH2O 32.5μl

  5×Q5buffer 10μl

  GC enhancer 10μl

  dNTP(10 mM)1μl

  Primer F(10μM)2.5μl

  Primer R(10μM)2.5μl

  Genomic DNA 1μl

  Q5 0.5μl

  总体积50μl

  表2.7高保真PCR程序步骤(Q5)

  反应温度反应时间反应循环数

  98℃1 min 1

  98℃10 sec

  NEB网站计算30 sec 30

  72℃视片段长度而定30 sec/kb

  72℃5 min 1

  16℃∞

  (2)跑胶、回收

  反应结束后,点样,并点入Marker,进行琼脂糖凝胶电泳跑胶约20分钟(160V电压),小心取出凝胶,在蓝光下观察,找到目的条带,并切胶,用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物,参考说明书,操作胶回收步骤。

  (3)重叠延伸PCR

  运用重叠延伸PCR技术将上述回收到的片段进行组装,得到模块PGAL1-PaCrtB-TPGK1,即PaCrtB片段。

  2.2.1.2酶切

  用HindIII、XhoI双酶切PaCrtB片段及含trp臂的载体,酶切体系如下表2.8所示。反应温度:37℃,反应时间:5h。

  表2.8 30μl酶切验证体系

  dd H2O 30-以下μl

  10×Buffer 3μl

  质粒1微克

  限制性内切酶0.2μl x几种酶

  总体积30μl

  酶切结束后,片段直接用普通DNA产物纯化试剂盒回收,参考说明书,操作纯化回收步骤。

  而载体需进行跑胶用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收,参考说明书,操作胶回收步骤。并将所得到的片段、载体做好标记保存于-20℃冰箱中备用。

  2.2.1.3连接转化

  将酶切后的片段及载体用T4DNA连接酶进行连接,准备CaCl2转化,连接体系如下表2.9所示。反应温度:22℃,反应时间:30min。

  表2.9连接体系

  片段6μL

  载体2.5μL

  10×Buffer 1μL

  T4DNA连接酶0.5μL

  总体积10μL

  用CaCl2转化法在超净工作台内完成步骤如下。

  (1)活化DH5α菌种,进行单菌落平板培养;

  (2)挑取单菌落接种于3 ml LB液体培养基中,经过过夜培养后,取400μl菌液到3ml LB液体培养基中,培养约2h,让吸光度达到0.6-0.8;然后将菌液倒入干净离心管中,常温下离心机5000rpm离心2min,收集菌体细胞;

  (3)尽量将上清液除尽,加入100μl 0.1M的冰冷的CaCl2溶液重悬菌体,静置冰浴5min,制成每管100μl的感受态细胞;将10μl连接产物轻轻加入100μl感受态细胞中,静置冰浴30min后,42℃温水浴热激45s,冰浴静置2min;

  (4)往管中加入1.0 ml LB液体培养基进行菌种复苏1小时,摇床设置37℃、160 rpm;离心5000 rpm,2min,收集菌体细胞沉淀;

  (5)弃除部分上清液,用剩余约100ul的上清液重悬后,将菌液涂板于含氨苄青霉素的LB固体筛选培养基,37℃,过夜培养。

  2.2.1.4转化子验证

  (1)菌落PCR

  挑取平板上的单菌落若干个,分别溶于10μl无菌水中,用FastTaqDNA聚合酶对转化子进行菌落PCR验证。菌落PCR体系及反应程序,如下表2.10和表2.11所示。引物:ScGAL1P_F_HindIII、ScPGK1t_R_XhoI,退火温度:52℃。

  表2.10验证PCR体系组成(FastTaq)

  加H2O至20μL 16.3μL/13.5μL

  10×FastTaq buffer 2μL

  dNTP(10 mM)0.5μL

  Primer F(10 mM)0.4μL

  Primer R(10 mM)0.4μL

  FastTaq 0.2μL

  质粒/菌液0.2μL/3μL

  总体积20μL

  表2.11验证PCR程序步骤(FastTaq)

  反应温度反应时间反应循环数

  94℃1 min 1

  94℃10 sec

  Tm±2℃15 sec 25

  72℃视片段长度而定20 sec/kb

  72℃5 min 1

  16℃∞

  (2)挑菌、传代培养

  反应结束后,点样,跑胶,在蓝光下观察,记录验证正确的转化子,找到对应的菌液,划线至LB固体培养基上,37℃培养箱过夜培养。第二天,在超净工作台中,挑取若干个单菌落接入对应的LB液体培养基的5ml带盖EP试管中,完成后,放入恒温摇床中过夜培养,37℃,180rpm。

  (3)提质粒

  待菌体浓度足够时,一部分存甘油菌保存于-80℃超低温冰箱备用,另一部分用质粒小提试剂盒分别提取各试管中的质粒,参考说明书,操作提质粒步骤。

  (4)酶切验证

  将所提质粒用HindIII、XhoI作小酶切验证,酶切验证体系如下表2.12所示。

  表2.12 10μl酶切验证体系

  dd H2O 10-以下μl

  10×Buffer 1μl

  质粒1微克

  限制性内切酶0.2μl x几种酶

  总体积10μl

  反应结束后,用小孔胶,点样,跑胶,蓝光下观察条带大小,取对应的部分甘油菌并送测验证。

  2.2.2构建重组酿酒酵母工程菌

  工程菌的构建流程如下图2.5所示。

  图2.5工程菌的构建流程图

  其中,酶切步骤同表2.8所示,酶:SacI、ApaI,反应温度:37℃,时间:过夜,扩增步骤同表2.6和2.7所示,引物:scLEU_LF、scLEU_RR,退火温度:60℃;胶回收采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,参考说明书,操作胶回收步骤。

  2.2.2.1酵母转化

  本文采用醋酸锂转化法将DNA片段整合到酿酒酵母基因组上,于超净工作台内操作,提前15min作好超净台灭菌工作。

  (1)接甘油菌或挑取单菌落于含3mlYPD液体培养基的试管中,放置于摇床(30℃,250rpm)过夜培养;将过夜培养物转接,至5mlYPD液体培养基的试管中,使初始OD600达到0.1,摇床培养约5h,使OD600达到0.5。

  (2)收集菌体细胞于干净的离心管中,离心(4000rpm,30s),然后用1ml无菌水重悬、离心后,重复3次操作;用1ml 0.1M醋酸锂重悬细胞后,室温静置10min,离心(4000rpm,30s),收集细胞,弃部分上清,用剩余100μl重悬细胞制成感受态细胞,冰浴保存。

  (3)准备,DNA片段20μl、ssDNA 20μl、50%PEG3350 480μl、1M醋酸锂72μl的转化体系;依次将转化体系加至100μl感受态细胞,高速涡旋5~10s,置于30℃水浴中孵育30min;加入72μl DMSO,高速涡旋5~10s,置于42℃水浴锅中热激30min。

  (4)离心(4000rpm,2min),弃上清,收集细胞,加入500μl 5mM CaCl2重悬细胞,室温静置10min。离心、弃上清液、1ml无菌水重悬清洗细胞,重复3次操作;用100μl无菌水重悬,涂布于营养缺陷型的YPD固体平板上,于30℃培养箱中过夜培养约2天。

  2.2.2.2工程菌筛选

  (1)菌落煮沸:观察平板,挑取若干个单菌落,做好标记,涮入对应的含20μl 20mM NaOH溶液的PCR管中,于99℃反应30min。

  (2)菌落PCR:配制菌落PCR体系,设置反应程序,如上表2.12和表2.13所示。

  (3)筛选:反应结束后,电泳跑胶,对照为重组前的酵母菌基因组,蓝光下观察目的条带,挑选验证正确的重组子,将对应的单菌落划线于YPD固体平板上,30℃培养箱中过夜培养,保存菌株。

  2.2.2.3酵母基因组提取

  (1)接种酵母菌于3ml YPD液体培养基的试管中,放置于摇床(30℃,250rpm)过夜培养;取过夜培养物置于干净的离心管中,离心(12000rpm,30s),弃上清液收集细胞。

  (2)加入石英砂(与细胞等体积),300μl破菌缓冲液STES(SDS)后,重悬细胞,再加入300μl酚氯仿混匀后,高速涡旋10min;接着加300μl TE缓冲液(EB),高速涡旋30s,离心(12000rpm,10min,4℃)。

  (3)取400μl上层水相至干净离心管内,加入40μl 3M的乙酸钠、1ml冰无水乙醇,倒置混匀,于-20℃冰箱中静置15min;离心(12000rpm,10min,4℃),弃上清液,收集白色沉淀。

  (4)用75%冰乙醇缓慢清洗沉淀,重复一次;于55℃金属浴中放置10min烘干,用10μl无菌水重悬后,保存。

  2.2.3发酵、提取与检测

  将构建的重组酵母菌Sc01P01和Sc01P02分别进行发酵、提取与检测步骤,依据HPLC结果分析比较两种菌生产八氢番茄红素的能力。

  2.2.3.1摇瓶发酵

  (1)活化一级种子:按1%接种量将甘油菌接种于5mlYPD试管培养基中,摇床培养(30oC、250rpm),使OD600至7~8。

  (2)培养二级种子:按初始OD600=0.2将一级种子转接到25ml YPD摇瓶培养基中,摇床培养(30oC、250rpm),使OD600=5-6。

  (3)发酵:按初始OD600=0.5将二级种子接种于50ml YPDG发酵培养基中,摇床培养(30oC、250rpm)66h。(其中重组酵母菌Sc01P01用20g/l葡萄糖的YPDG发酵培养基,重组酵母菌Sc01P02用40g/l葡萄糖的YPDG发酵培养基,且每组设置3个平行实验。)

  2.2.3.2八氢番茄红素提取

  发酵结束后,取两等份的发酵液,离心(4000rpm 2min),收集菌体细胞,弃上清液,用无菌水重悬清洗细胞2次。将其中一份置于80℃烘干至恒重,称量计算细胞干重m1(单位:g DCW/L)。

  用另一份菌体提取产物。对细胞进行破壁处理,用1ml 3M HCl重悬细胞后,于沸水浴中煮沸2min;立即冰浴5min后,12000rpm离心5min(4℃),用无菌水重悬清洗细胞2次,加入1ml含1%(w/v)BHT的丙酮,高速涡旋5min,离心收集丙酮相,用0.22μm滤膜过滤后收集于样品瓶中,准备用HPLC检测。

  2.2.3.2八氢番茄红素的检测

  根据下表设置高效液相色谱仪(HPLC)相关参数,进样检测后,用八氢番茄红素标品进行定量分析并计算八氢番茄红素的单位细胞产量(单位:mg/g DCW)。

  表2.16 HPLC参数

  流动相甲醇、乙腈、二氯甲烷=21:21:8

  固定相C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)

  柱温30℃

  流速1.0 ml/min

  检测器紫外检测器287nm

  3结果与讨论

  3.1 TRP臂_PaCrtB质粒的构建

  3.1.1 CrtB片段的PCR结果

  对小片段扩增后,重叠延伸PCR组装,最终得到PGAL1-PaCrtB-TPGK1(CrtB)片段,凝胶电泳后结果如下图3.1所示。

  图3.1 CrtB片段PCR的凝胶电泳图

  1、2—CrtB片段;M—Marker

  CrtB片段大小为1600bp,从上图可观察到,条带介于1000bp至2000bp之间的偏中部位置,所以CrtB片段的PCR结果正确。

  3.1.2含trp臂载体的酶切结果

  用HindIII、XhoI酶切得到载体,凝胶电泳后结果如下图3.2所示。

  图3.2含trp臂载体酶切的凝胶电泳图

  1、2—载体;M—Marker

  酶切后的载体大小为6500bp,图中的第二条条带最亮,且位置介于5000bp与8000bp之间,所以第二条条带为所需的载体,酶切结果正确。

  3.1.3 TRP臂_PaCrtB质粒的菌落PCR筛选结果

  用引物ScGAL1P_F_HindIII、ScPGK1t_R_XhoI,挑选12个转化子进行菌落PCR,凝胶电泳后结果如下图3.3所示。

  图3.3转化子菌落PCR的凝胶电泳图

  1~12—转化子;M—Marker

  菌落PCR后的条带大小为1600kb,从上图可观察到,条带位置在1000bp至2000bp之间,且不含杂带的正确。挑选转化子2、4、8、12,进行酶切验证。

  3.1.4 TRP臂_PaCrtB质粒的酶切验证结果

  用HindIII、XhoI进行质粒酶切验证,凝胶电泳后结果如下图3.4所示。

  图3.4转化子酶切验证的凝胶电泳图

  1~4—转化子;M—Marker

  酶切后的条带大小为1600kb,从上图可观察到,图中应有两条带,且其中一条带位置在1000bp至2000bp之间,故转化子1、2、4正确,进一步测序验证则转化子1正确,成功构建TRP臂_PaCrtB质粒。图中出现条带弯曲是由于倒模具制胶时的温度过低,使胶冷却后不均匀导致的。

  3.2重组酵母菌的构建

  3.2.1重组菌Sc01P01的构建结果

  通过overlap PCR得到PaCrtB片段,连接转化,验证得到TRP臂_PacrtB质粒,酶切得到TRP臂_PaCrtB片段,酵母转化整合进底盘酿酒酵母菌中,验证得到重组酵母菌Sc01P01。

  3.2.1.1 TRP臂_PaCrtB片段的酶切结果

  用SacI、ApaI双酶切得到TRP臂-PaCrtB片段,凝胶电泳后结果如下图3.5所示。

  图3.5 TRP臂-PaCrtB片段的酶切凝胶电泳图

  1、2—片段;M—Marker

  酶切后的TRP臂-PaCrtB片段大小为3000bp,从上图可观察到,图中对应的3000bp条带正确,切胶、回收后准备酵母转化。

  3.2.1.2菌落PCR筛选结果

  用引物验证TRP臂、PGAL1-PaCrtB-TPGK1是否整合进底盘菌中,验证结果如下图3.6所示。

  图3.6 Trp臂-PaCrtB片段整合验证的凝胶电泳图

  1—Trp臂-PaCrtB质粒;2—底盘菌基因组;3~6—酵母转化子;M—Marker

  其中图3.6-A的验证引物为ScCrtB_vF、ScCrtB_vR,扩增出562bp的条带为正确,故酵母转化子3~6都正确;图3.6-B验证引物为ScTRP_vF、ScTRP_vR,扩增出705bp的条带为正确,故酵母转化子3~6正确;图3.6-C验证引物为ScTPR_LF、ScCrtB_vR,扩增出1700bp的条带为正确,故酵母转化子3~6正确;图3.6-D验证引物为ScCrtB_vF、ScTRP_RR,扩增出1800bp的条带正确,故酵母转化子4~6正确;通过上述验证,最终酵母转化子4、5、6整合正确。

  3.2.2重组菌Sc01P02的构建结果

  用LEU臂_tHMG1-TmCrtE质粒,PCR扩增得到LEU臂_tHMG1-TmCrtE片段,酵母转化整合进重组酵母菌Sc01P01,验证得到重组酵母菌Sc01P012。

  3.2.2.1 LEU臂_tHMG1-TmCrtE片段的PCR结果

  用引物scLEU_LF、scLEU_RR进行PCR扩增得到LEU臂_tHMG1-TmCrtE片段,凝胶电泳后结果如下图3.7所示。

  图3.7 LEU臂-tHMG1-TmCrtE片段的PCR凝胶电泳图

  1、2—片段;M—Marker

  LEU臂-tHMG1-TmCrtE片段大小为6600bp,从上图可观察到,此片段条带应是介于5000bp至6000bp之间的条带,切胶回收后,进行酵母转化。图中条带较暗,可能由质粒浓度过低导致的。

  3.2.2.2菌落PCR筛选结果

  用引物验证LEU臂、TACT1-tHMG1-PGAL10-PGAL1-TmCrtE-TGPM1是否整合进重组酵母菌Sc01P01,验证结果如下图3.8所示。

  图3.8 LEU臂-tHMG1-CrtE片段整合验证凝胶电泳图

  1~4—酵母转化子;5—酵母菌Sc01P01基因组;M—Marker

  其中图3.8-A验证引物为LEU_F1、ScLEU_RR,未扩增出1328bp的条带为正确,故酵母转化子1~4都正确。图3.8-B验证引物为TmE_F、TmE_R,扩增出1100bp的条带为正确,故酵母转化子1、3、4正确。通过上述验证,最终酵母转化子1、3、4整合正确。

  3.3八氢番茄红素产量分析

  酿酒酵母能通过体内MAV途径生物合成八氢番茄红素的底物GGPP(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸),其后在八氢番茄合酶(crtB基因)的催化下,合成八氢番茄红素[8]。为了获得能生产八氢番茄红素的初始酵母菌,引入来源于成团泛菌的crtB基因组成整合型TRP臂_PaCrtB质粒,整合到底盘酿酒酵母上。筛选得到阳性菌株3株,经摇瓶发酵66h后,HPLC定性定量分析,将产量最高的菌命名为Sc01P01,其八氢番茄红素产量为。