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论文写作模式-香蕉枯萎病菌4号小种多聚半乳糖醛酸酶的真核表达

2021-06-08 16:26:35

  微生物果胶酶也是果汁澄清的主要酶制剂之一,具有降低果蔬浆的粘度的作用。课题组前期研究发现香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)具有强大的果胶酶系统能够有效降解寄主细胞壁中胶层,其中多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)表现出良好的果胶酶活性,具有果汁加工的潜在应用价值。

  随着生物技术的发展,利用基因工程技术开发重组蛋白己获得广泛应用。毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)真核表达系统具有甲醇诱导的强启动子,外源基因能有效整合于酵母染色体上。同时毕赤酵母真核表达具有高表达、高稳定、高密度发酵、适度糖基化、表达产物生物活性好、发酵纯化操作方法简便等优点,在真核生物重组蛋白研究和工业化生产上大受青睐,目前许多极具价值的真核生物蛋白已通过该系统获得了成功表达。因此,本研究采用毕赤酵母外源蛋白真核表达系统解决了香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race four,Foc4)多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)在自然或人工培养条件下产量低的问题,为探讨其在果汁澄清中的作用效果研究奠定了研究基础。

  本研究利用已成功构建的真核表达载体pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6,通过单线性化处理后电击转入毕赤酵母Pichia pastoris GS115菌株中。获得酵母转化子后提取其DNA进行PCR验证。随后将筛选出的阳性酵母转化子进行甲醇诱导表达,收集表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测,成功获得了PGC3~PGC6重组蛋白。通过酶活检测,确定了PGC3~PGC6重组蛋白具有果胶酶活性。本研究结果将为PGC3~PGC6的果汁澄清效果研究提供材料。

  毕赤酵母是甲基营养酵母,甲醇是其唯一的碳源,因其载体含性能强大可被甲醇诱导的AOX1启动子,所以在含甲醇的条件下能被强烈上调,但是在葡萄糖或甘油存在的条件下其表达受到抑制。然而,新的研究发现在某些条件下启动子是泄露的,因为在生物反应器培养的细胞中,蛋白质的表达发生在诱导前阶段,而不是在摇瓶中。毕赤酵母载体通常经整合到宿主细胞的基因组中,以此来产生稳定表达的克隆,现作为重组表达宿主被广泛应用。毕赤酵母非常适合使用生物反应器进行大规模、高密度培养的这一特性与相对廉价的生长培养基相结合,使其成为了一种经济、高效的系统(Byrne,2015)。

  毕赤酵母真核表达系统结合了真核共译、翻译后处理系统和脂质组成的特点,被广泛应用于工业生产。虽然大肠杆菌生长迅速、养殖简单、安全性好,被研究者了解得比较透彻,但大肠杆菌表达系统常使表达产物形成包涵体,使得蛋白质活性受到抑制,此后需要复杂性操作才能恢复蛋白质相应活性。大肠杆菌表达系统的这一特性使得毕赤酵母表达系统深受人们喜爱,其优点如下:(1)培养成本低廉。毕赤酵母的生长培养只需少量的营养,适合工业化生产应用。(2)安全性高。例如将能产生有毒有害物质的真菌的基因在毕赤酵母表达系统中进行异源表达则不会产生有毒有害物质。(3)高稳定。能与外源基因组稳定重组,且经过多代培养后外源基因仍然存在。(4)甲醇诱导表达。(5)适度糖基化。(6)高表达。当外来基因转入毕赤酵母系统后,蛋白在细胞内外均有分泌,而且毕赤酵母没有杂蛋白产生,比较有利于纯化目的蛋白(杨湘越等,2003)。

  综上所述,毕赤酵母真核表达系统具有许多其他蛋白表达系统所不具备的优点,如具有甲醇诱导的强启动子,外源基因能有效整合于酵母染色体上。同时毕赤酵母真核表达安全性高、表达稳定、成本低廉、试验操作简单等,使其在真核生物重组蛋白研究和工业化生产上大受青睐,目前许多极具价值的真核生物蛋白已通过该系统获得了成功表达(候增淼等,2019)。随着科学技术的飞速发展,毕赤酵母真核表达系统将不断地被优化,将不断地被投放到多个生产领域,发挥其独具的优势,为社会、经济等创造出极大的价值。

  1.1.1.1毕赤酵母真核表达系统的应用现状

  随着生物技术的不断进步,进行蛋白异源表达试验时毕赤酵母真核表达系统是最佳选择之一,利用基因工程技术开发重组蛋白己获得广泛应用。当今,培养成本低,生长周期短且可以进行高密度培养的的毕赤酵母外源蛋白的表达量占细胞总蛋白的量可达5%~40%,重组毕赤酵母表达载体经电击转化即可整合到毕赤酵母基因组上,这种整合非常稳定,为外源基因的表达提供了保障(王继雪等,2018)。酵母真核表达系统为外源表达微生物多聚半乳糖醛酸酶基因的优点在于蛋白产量较高、操作简单、价格低廉并对人体安全等,在基因表达领域被研究者们广泛应用。

  经较多实验研究表明,毕赤酵母真核表达系统在多方面优越于其他表达系统,而且应用毕赤酵母表达的蛋白能用于临床研究,如重组毕赤酵母分泌的破伤风毒素片段C较多,能达到12 g/L。而且Yang等(2011)和Tu等(2013)将嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1酸性endo-PG基因pga1和嗜热真菌Achaetomium sp.Xz8的endo-PG基因pg I进行了真核表达,提供了技术参考。许天敏等(2014)将rhuPA a-melittin在毕赤酵母中的表达及其对卵巢癌靶向治疗的研究中首次在毕赤酵母中高效表达rhuPA a-melittin;王曼(2014)采用毕赤酵母系统表达的EV71和EVB疫苗候选抗原,通过优化抗原编码序列,成功表达及纯化得到了高产量的抗原蛋白。

  1.1.2Foc4多聚半乳糖醛酸酶的真核表达

  1.1.2.1微生物多聚半乳糖醛酸酶特点及应用

  微生物是一切微小生物(细菌、病毒、真菌和少量藻类等)的统称,肉眼难以观察到,需要借助显微镜等工具才能一睹它们的风采。多聚半乳糖醛酸酶是一种分解果胶质,降解细胞壁的果胶酶,经研究发现在微生物、高等植物、某些昆虫以及原生动物中均有存在。果胶酶在细菌、放线菌、酵母以及霉菌中都能通过代谢合成(韩爽,2011)。其中,真菌类的果胶酶主要通过裂解作用或者消去作用切断果胶质的糖苷键,从而将果胶质裂解为多聚半乳糖醛酸。根据对底物作用方式的不同可分为不同的类型,最为重要的是多聚半乳糖醛酸酶(PG)。

  真菌PG属28基因家族成员,通过序列比较分析来源于曲霉属(Aspergillus),青霉属(Penicillium),葡萄孢属(Botrytis),镰刀菌属(Fusarium)及核盘菌属(Sclerotinia)等的43种PG发现,它们的整体序列的一致性为8.9%,相似性为17.4%(韩爽,2011)。而且真菌PG大多都为诱导酶和分泌型胞外酶,果胶、果胶酸、植物维管组织等都可以作其诱导物。除此之外,绝大多数微生物的PG的最适反应pH值范围一般为3.2~5.6。PG适于低温保存,50%的甘油有助于提高A.niger的PG稳定性(蔺凌云,2010)。

  目前,果胶酶被广泛应用到果酒、果汁及中药营养液等食品深加工中,使得产品从外观到质量都得以改善(郭鸿飞,2007)。因此,曲霉属中的黑曲霉分泌的胞外酶全,产量高,而且pH值一般都在酸性范围内,是安全菌株,所以被广泛应用于食品加工业中。同时,可以利用果胶酶分解植物细胞壁的特点,将其用于果蔬汁的生产;天然产物的提取;纺织品的生物脱胶;造纸业的生物制浆等工业中。

  1.1.2.2Foc4多聚半乳糖醛酸酶特点及功能

  香蕉枯萎病菌是对全球香蕉产业迫害最严重的植物病原真菌,属半知菌亚门,镰孢菌属,是尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)真菌(Ploetz,2015)。香蕉枯萎病菌1号小种(Foc1)全世界分布,主要侵染粉蕉,但香蕉较抗病,4号生理小种(Foc4)几乎能感染所有品种,危害最为严重(秦世雯,2017)。

  香蕉枯萎病菌的主要致病因子是细胞壁降解酶(cell-wall degrading enzymes,CWDEs),细胞壁降解酶主要分为纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶和角质酶等,其中果胶酶是病原菌的主要致病因子,在致病过程中起着重要作用(王鹏程,2019)。香蕉枯萎病菌分泌的果胶酶是降解植物细胞壁果胶的一组复合细胞壁降解酶。果胶酶最初在产生软腐症状的植物组织中发现,能够降解植物果胶骨架结构,主要包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基半乳糖醛酸酶、多聚半乳糖醛酸反式消除酶,和果胶甲基反式消除酶等(Brink et al.,2011),有利于香蕉枯萎病菌的侵入和定殖。

  多聚半乳糖醛酸酶(PG)是一种水解酶,根据其作用方式可分为外切多聚半乳糖醛酸酶(exo-PG)和内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)两种。前者通过水解果胶分子的非还原端,产生半乳糖醛酸,而后者则随机地在不同部位水解切开α-1-4-半乳糖苷键,将多聚半乳糖醛酸链降解为半乳糖醛酸和寡聚半乳糖醛酸,使细胞壁结构解体导致果实软化(白延红等,2008)。

  目前研究已从果胶诱导条件下纯化和鉴定了香蕉枯萎病菌的6个PG(PGC1~PGC6),其中PGC1和PGC5为endo-PG,PGC2,PGC3,PGC4和PGC6为exo-PG(秦世雯,2017)。6个PG均具有较高的果胶酶活性。

  香蕉枯萎病菌在自然或人工培养条件下果胶酶的产量较低造成其酶学活性和相关研究受限(Dong et al.,2015;Fan et al.,2017),而且毕赤酵母真核表达系统为外源表达微生物PG基因,为其编码蛋白功能的研究提供了一个方便可行的途径(Yang et al.,2011;Yuan et al.,2011;Cho et al.,2012)。因此,本研究拟对香蕉枯萎病菌6个PG进行毕赤酵母外源真核表达,体外获取足够产量的PG,本研究结果将为PGC3~PGC6的果汁澄清效果研究提供材料,同时为进一步探索香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的功能奠定基础。

  1.2研究目的和意义

  本试验通过对香蕉枯萎病菌4号小种Fusarium oxysporum f.sp.cubense race four(Foc4)多聚半乳糖醛酸酶(PG)进行酵母外源蛋白真核表达,将已成功构建的真核表达载体pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6单线性化处理后电击转入Pichia pastoris GS115(毕赤酵母)中,获得酵母转化子后提取其基因组进行PCR验证,将筛选出的阳性酵母转化子进行甲醇诱导表达,经SDS-PAGE分析、Western blot检测以及粗酶活性测定后,获得纯化的、高产量的PGC3~PGC6。从而来解决香蕉枯萎病菌在自然或人工培养条件下PG产量低的问题,获得足够产量的PG,为香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的功能挖掘和技术应用奠定基础,以及为果汁澄清效果研究提供材料。

  2实验材料和试验方法

  2.1实验材料

  2.1.1供试菌株

  香蕉枯萎病菌4号小种Fusarium oxysporum f.sp.cubense race four(Foc4),存于云南大学农学院。

  2.1.2宿主菌

  Pichia pastoris GS115(毕赤酵母)菌株,存于云南大学农学院。

  2.1.3供试载体

  真核表达载体pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6,由实验小组成员成功构建,存于云南大学农学院。

  2.1.4主要仪器和设备

  超速冷冻离心机、冷藏柜、PCR仪、凝胶自动分析仪、核酸水平电泳仪,实时荧光定量PCR仪、核酸蛋白检测仪、气浴控温摇床、电转仪、微生物培养箱、无菌操作台、蛋白垂直电泳仪等。

  2.1.5主要试剂及溶液配制

  YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培养基:5 g酵母浸出物,10 g胰蛋白胨,10 g葡萄糖,定容至500 mL,然后分装锥形瓶高温灭菌,即为液体YPD液体培养基,在定容前加入10 g琼脂粉即为固体YPD培养基。

  1 mol/L山梨醇:称取山梨醇18.2 g,容量瓶定容至100 mL,高温高压灭菌。

  YPDS培养基:酵母浸出物5 g,胰蛋白胨10 g,山梨醇91.1 g,葡萄糖10 g,定容至500 mL,为YPDS液体培养基,定容前加入10 g琼脂粉即为固体YPDS培养基。

  50×TAE电泳缓冲液(母液):Tris 242 g,Na2EDTA·2H2O 37.2 g于1 L烧杯中,向烧杯中加入800 mL ddH2O,充分搅拌均匀,加入57.1 mL的冰乙酸,充分溶解,用NaOH调节pH至8.3,再用双蒸水定容至1 L,室温保存。稀释10倍即为工作液。

  1%琼脂糖凝胶:称取1 g琼脂糖于200 mL锥形瓶中,加入1×TAE缓冲液100 mL,微波炉加热至琼脂糖全部熔化,冷却至60°C左右,倒板。

  BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium)培养基:溶解10 g酵母浸出物,20 g胰蛋白胨于700 mL水中,高压灭菌,冷却至室温,加入100 mL 1 mol/L磷酸钾缓冲液,2 mL 500×B,100 mL 10×YNB,100 mL 10×GY。

  BMMY(Buffered Methanol-complex Medium)培养基:除10×GY改为10×M外,其余组分及配制方法同BMGY培养基。

  SDS-PAGE电泳凝胶储液:Acr 30 g,Bis 0.8 g,加双蒸水100 mL,过滤,棕色瓶4°C保存。

  2.2试验方法

  2.2.1真核表达载体pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6的转化

  2.2.1.1酵母感受态的制备

  感受态细胞细胞膜通透性发生变化,是一种容易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态。制备方法如下:

  (1)于进行转化实验的三天前,在已经准备好的3个YPD固体培养基上接种Pichia pastoris GS115,28℃的微生物培养箱中培养,直至长出菌株单菌落;

  (2)挑选单菌落分布明显的YPD固体培养基平板中生长的Pichia pastoris GS115菌株单菌落,用0~10 uL的移液枪枪头挑取并分别接种到5 mL YPD液体培养基中(3份),在28°C,250 rpm的气浴控温摇床中振荡培养过夜,得到种子液;

  (3)准备已高温灭菌的500mL三角瓶3个,从培养较优的种子液中取500μL接种于分别含150 mL新鲜YPD液体培养基的三角瓶中,再置于28℃,200 rpm的气浴控温摇床中振荡培养,直至菌液OD600约为1.3~1.5;

  (4)从摇床中取出含有菌液(OD600≈1.3~1.5)的三角瓶在冰上放置10 min,使菌液冷却至0°C;同时,将准备好的50 mL离心管、无菌水和山梨醇(1 mol/L)置于4℃冰箱里冷却备用;

  (5)将预冷好的菌液平均倒入预冷的4个离心管中,各37.5 mL,离心5 min(4000 rpm/min,4°C),倒出培养液,将管倒置以使培养液流尽,能最大限度地去除YPD培养基;

  (6)离心管中的沉淀用等体积的预冷地无菌水(37.5 mL)重悬,离心5 min(4000 rpm/min,4°C);

  (7)用1/2体积的预冷无菌水(18.75 mL)重悬,离心5 min(4000 rpm/min,4°C);

  (8)用5 mL预冷的1 mol/L山梨醇溶液重悬,离心5 min(4000 rpm/min,4°C);

  (9)用200 uL预冷的1 mol/L山梨醇溶液重悬,离心5 min(4000 rpm/min,4°C);

  (10)-4℃冰箱保存,当天使用。

  2.2.1.2线性化重组表达质粒的制备

  将pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6重组表达质粒以及pPICZαA空载体进行线性化单酶切,选用SacⅠ限制性内切酶。体系(50μL)如表1所示,酶切后将产物置于37℃恒温培养箱中反应过夜,-20℃保存备用。

  pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6 pPICZαA

  DNA 30μL 30μL

  SacⅠ2.5μL 2.5μL

  10×L Buffer 5μL 5μL

  ddH2O 12.5μL 12.5μL

  2.2.1.3电转化感受态Pichia pastoris GS115

  (1)取出-4℃冰箱内保存的感受态细胞置于冰上融化,同时将0.2 cm电击杯(3个)和1 mol/L山梨醇溶液置于冰上预冷;

  (2)分别用移液枪取出80μL感受态毕赤酵母与达到5-10 ug标准的pPICZaA-pgc3~pPICZaA-pgc6线性化重组质粒表达载体混合反应后移入预冷的0.2 cm间隙的电击杯,用手指轻轻弹击电击杯,使混合物落入电击杯的底部,作好标记,置于冰上,冰浴5 min;

  (3)将电击杯分别置电转仪上,选择合适参数进行电击转化,一般选择电压1.5 kV;电容25μF;电阻200Ω;电击时间为4~10 ms;

  (4)电击后立即加入1 mL预冷的山梨醇,然后将电击杯中的混合物全部转移到无菌的1.5 mL离心管中,28℃下温浴1-2 h;

  (5)制备YPDS培养基9个,加入Zeocin抗生素;

  (6)将菌液低速离心5 min,除去部分上清,分别吸取50μL转化菌液进行涂布,置于28℃微生物培养箱中倒置培养48-72 h,直至转化子出现;

  (7)该试验同时取pPICZaA空载体线性化电击转化作为对照。

  2.2.2 pgc3~pgc6的酵母转化子的筛选

  2.2.2.1酵母基因组提取

  参照酵母基因组提取试剂盒(TIANamp Yeast DNA Kit)说明书进行提取。

  (1)将重组质粒和空质粒转化子接种到含Zeocin抗生素的5 mL YPD液体培养基

  中,置于28℃摇床中振荡培养16~18 h;

  (2)离心1 min(室温,13000 rpm),去上清,重复多次离心将收集菌体到

  同一离心管中;

  (3)裂解酶:加入600μL山梨醇缓冲液和200 U Lyticase,充分混匀后30℃下处理30min;

  (4)加入200μL Buffer GA重悬细胞颗粒,用旋涡搅拌,充分混匀;

  (5)加入20μL蛋白酶K,充分混匀;

  (6)加入220μL Buffer GB,上下颠倒,充分混合,在70℃下处理10min后短暂离心;

  (7)加入220μL无水乙醇,上下颠倒,充分混匀,生成的白色絮状沉淀和溶液一起转移至吸附柱CB3中,离心半分钟(13000 rpm),倒废液;

  (8)向CB3中加入500μL Buffer GD,离心30 s(13000 rpm),倒废液;

  (9)向CB3中加入700μL漂洗液PW,离心30 s,转速13000 rpm,倒废液;

  (10)向CB3中加入500μL漂洗液PW,13000 rpm离心30 s,倒废液;

  (11)空柱离心2 min(13000 rpm),倒废液,开盖,室温放置,除尽无水乙醇;

  (12)换管,将吸附柱放置新的1.5 mL离心管中,向吸附膜中间悬空滴入60μL 65℃预热的洗脱缓冲液TE,室温放置5 min后离心1min(13000 rpm),洗脱液即为酵母基因组DNA。

  2.2.2.2酵母转化子PCR鉴定

  用无菌的0-10μL移液枪枪头挑取少量白色菌落,置于含10μL ddH2O的无菌的PCR管中,以菌落为模板,采用一对由pPICZaA载体上具有的检测引物扩增提取的酵母基因组DNA——5’AOX1 Pichia Primer和3’AOX1 Pichia Primer进行扩增,从而确定线性化质粒是否与酵母基因组相整合。反应配合液配制体系如下:

  菌液1μL

  dNTPs 2μL

  10×PCR Buffer 2.5μL

  5’AOX1 Pichia Primer 0.5μL

  3’AOX1 Pichia Primer o.5μL

  Taq DNA聚合酶0.25μL

  ddH2O 18.25μL

  Total 25μL

  将反应液轻轻震荡充分混匀后短暂离心,进行PCR扩增,反应条件如下:

  94℃3 min

  94℃30 s

  55℃30 s

  72℃2 min

  72℃7 min

  PCR扩增反应结束后,吸取少量反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

  2.2.3 PGC3-PGC6同工酶的真核表达及鉴定

  2.2.3.1转化子的甲醇诱导表达

  (1)挑选转化后在YPDS培养基平板上的阳性克隆菌株单菌落接种于装有25 mL BMGY培养基的250 mL的三角瓶中,在28℃,250 rpm摇床中振荡培养至OD600=2~6,约48 h,同时以空载体为对照;

  (2)离心5 min(3000 rpm,室温),弃上清,收集菌体后用原培养液体积的1/5~1/10重悬菌体(约10~20 ml);

  (3)将所得菌液中置于100 mL三角瓶中振荡培养(28°C,200 rpm),每隔24 h补充一次浓度为100%的甲醇至终浓度为0.5%,同时补充灭菌ddH2O,保持发酵液总体积;

  (4)连续诱导培养3 d,取样时间点设为:12、24、36、48、60、72 h,每12 h取1 mL菌液,最大转速离心2~3 min,离心后上清和菌体分别收集保存;

  (5)上清和沉淀分别保存于-80°C冰箱,用于SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。

  2.2.3.2表达产物SDS-PAGE电泳分析

  取甲醇诱导培养得到的上清进行SDS-PAGE电泳表达,操作如下:

  (1)制胶仪器清洗。玻璃板,依次使用H2O、10%SDS、ddH2O冲洗,所有仪器都要保持干燥无尘,方可使用;

  (2)配制12%分离胶(配方如表2):

  表2 12%分离胶配制表

  试验试剂体积

  30%凝胶储存液3.0 mL

  1.5 mol/L pH8.8 Tris-HCl 2.5 mL

  ddH2O 2.45 mL

  10%SDS 75μL

  10%AP 75μL

  TEMED 4μL

  总体积7.5 mL

  (3)将分离胶溶液注入准备好的玻璃板间隙中;

  (4)加完分离胶后用1.5 mL ddH2O封好胶面,室温静置30 min;

  (5)待分离胶聚合凝固后,倾倒出ddH2O并用吸水纸吸干残留液体;

  (6)配制3%浓缩胶(配方如表3):

  表3 3%浓缩胶配制表

  试验试剂体积

  30%凝胶储存液0.85 mL

  0.5 mol/L pH6.8 Tris-HCl 0.6 mL

  ddH2O 3.5 mL

  10%SDS 50μL

  10%AP 50μL

  TEMED 5μL

  总体积5 mL

  (6)在分离胶上端缓慢注入配制好的浓缩胶,插上梳子,防止气泡产生;

  (7)待浓缩胶聚合凝固后拔出梳子,随后将凝胶放入电泳槽中并加入1×SDS电泳缓冲液;

  (8)准备蛋白质样品。在0.5 mL离心管中加入5μL 5×SDS Loading Buffer和蛋白样品15μL,充分混匀,沸水浴5 min,取出冷却至室温。

  (9)上样。将蛋白样品用移液枪缓慢地加入凝胶凹形样品槽的底部。

  (10)加入已知蛋白分子量的标准品,开始电泳;初始电压80 V,待蛋白样品溴酚蓝指示剂移至分离胶界面时将电压升至120 V,继续电泳;指示剂移动至分离胶底部,即刻停止电泳。

  (11)谨慎地撬开玻璃板,取出凝胶置于考马斯亮蓝R-250染色液中染色,脱色摇床上缓慢振荡30~60 min。

  (12)弃去染色液,将凝胶在ddH2O中漂洗数次,加入脱色液中缓慢摇动,多次更换脱色液直至出现清晰的蛋白条带。

  相对分子量的测定:以SDS-PAGE电泳中标准蛋白的相对迁移率(Rf)为横坐标,以标准蛋白分子量的对数值为纵坐标,做标准曲线,根据目标蛋白的Rf值,通过标准曲线计算目标蛋白的相对分子量。

  2.2.3.3 PGC3-PGC6同工酶的Western blot鉴定

  (1)剪裁PVDF膜,并提前在膜的右上角剪一个角,在膜的右下角作标记;

  (2)将膜在甲醇溶液中浸湿10~15 s后立即放进装有ddH2O的培养皿中漂洗5~10 s后立即放入在冰上预冷的盛有转膜缓冲液的培养皿中平衡20~30 min;

  (4)配制封闭液:PBS中按1:500~1:1000加入Tween 20;

  (5)转膜后将膜放入封闭液中,在25℃左右封闭1~1.5 h或着4℃下封闭过夜,期间置于摇床上轻微摇晃;

  (6)加入与封闭液对应比例的一抗混匀后,立即将封闭液中的膜转移到一抗中,25℃左右杂交或4℃杂交过夜,期间置于摇床上轻微摇晃;

  (7)每10分钟一次将膜从一抗中取出用PBS/PBST溶液交替清洗5~6次;

  (8)根据一抗的种类选择加入和封闭液对应比例的二抗(如2μl,1:10000)混匀后将洗好的膜快速转移到二抗溶液中,置于摇床上轻微摇晃,室温下杂交1~2 h;

  (9)重复操作(7);

  (10)显影,将洗好的膜浸泡在PBS中带到暗室,将PVDF膜轻放在事先铺好的保鲜膜上,用滤纸擦干膜表面的水,在黑暗条件(安全红灯下)下配制显色底物,用移液枪将显色底物加到PVDF膜表面并用枪头均匀涂抹开,再用保鲜膜覆盖,并将剪裁好的X-光片平整地压在PVDF膜上,静置一段时间后迅速的移开,放入预先倒出来的显影液中,置于摇床上摇晃显影液盒,待其条带清晰后放入水中漂洗,漂洗后立即放入到定影液中。

  2.2.3.4香蕉枯萎病菌PGC3-PGC6真核表达产物的粗酶活测定

  (1)配制1%PGA溶液:用50 mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液配制,pH 5.0;

  (2)取400μL粗酶液、400μL的1%PGA溶液和400μL 50 mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液混合,45℃下水浴30 min;

  (3)加入0.6 mL DNS试剂终止反应,充分混匀后沸水浴5 min,冷却至室温;

  (4)向各管加入2.2 mL ddH2O,摇匀,测OD520nm数值;

  (5)最后,取所测样品的平均OD值,然后在标准曲线上查出相应的还原糖含量。

  (6)将对照设为沸水浴15 min的粗酶液,进行相同操作。

  3结果与分析

  3.1香蕉枯萎病菌pgc3-pgc6酵母转化子的筛选

  pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6通过线性化电击转入Pichia pastoris GS115后,在含有Zeocin的YPDS平板培养基上进行培养和筛选,如图1所示,融合了pgc3-pgc6基因的酵母转化子在含有Zeocin的YPDS平板培养基上形成了白色菌落,挑取菌落于含有Zeocin的YPD培养液中进行扩繁,用于后续检验。

  图1 pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6酵母转化子在YPDS培养基上的菌落形态

  A:pPICZαA-pgc3酵母转化子;B:pPICZαA-pgc4酵母转化子;C:pPICZαA-pgc5酵母转化子;D:pPICZαA-pgc6酵母转化子

  3.2香蕉枯萎病菌pgc3-pgc6酵母转化子DNA的提取

  利用酵母基因组提取试剂盒对上述酵母转化子的DNA进行提取和电泳检测。结果如图2所示,pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6酵母转化子酵母DNA提取质量良好,无蛋白等杂质污染,可进行后续的PCR检测。

  图2 pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6酵母转化子DNA的电泳图

  A:pPICZαA-pgc3酵母转化子DNA;B:pPICZαA-pgc4酵母转化子DNA;C:pPICZαA-pgc5酵母转化子DNA;D:pPICZαA-pgc6酵母转化子DNA。M为DNA Marker。

  3.3香蕉枯萎病菌pgc3-pgc6酵母转化子的PCR鉴定

  以pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6酵母转化子DNA为模板,利用AOX1-F和AOX1-R引物进行PCR扩增,扩增产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图3所示,扩增产物片段大小与预期片段大小相符,说明线性化质粒pgc3~pgc6已稳定地整合入酵母基因组内。另外,除目的基因片段外,还扩增出一条2200 bp的AOX1基因片段,说明pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6经线性化处理后,插入到酵母AOX1上游或下游,所以所筛选的酵母转化子均为HIS+Mut+型。

  图3 pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6酵母转化子的PCR扩增片段电泳图

  A:pPICZαA-pgc3 PCR扩增片段;B:pPICZαA-pgc4 PCR扩增片段;C:pPICZαA-pgc5 PCR扩增片段;D:pPICZαA-pgc6 PCR扩增片段。M为DNA Marker。

  3.4香蕉枯萎病菌PGC3-PGC6真核表达产物的检测

  将阳性酵母转化子进行真核表达,甲醇诱导培养后每12 h进行上清液的收集,随后进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。如图4~图7所示,、PGC3-PGC6重组蛋白的相对分子量分别约为70 kDa、60 kDa、40 kDa、55 kDa,PGC3和PGC4重组蛋白的相对分子量相较于基因编码氨基酸序列的预测蛋白分子量大,而PGC5和PGC6与基因推导氨基酸序列的蛋白分子量相符,可能是由于PGC3和PGC4存在多个糖基化位点,表达过程中蛋白糖基化,造成分子量变大。pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6酵母转化子随着发酵时间的增长,表达蛋白量逐渐增多,60 h和72 h蛋白量趋于稳定(图4~图7)。

  图4 pPICZαA-pgc3酵母转化子真核表达的SDS-PAGE检测

  M:Protein Marker;12-72:分别为甲醇诱导表达12、24、36、48、60、72h的蛋白样品。

  图5 pPICZαA-pgc4酵母转化子真核表达的SDS-PAGE检测

  M:Protein Marker;12-72:分别为甲醇诱导表达12、24、36、48、60、72h的蛋白样品。

  图6 pPICZαA-pgc5酵母转化子真核表达的SDS-PAGE检测

  M:Protein Marker;12-72:分别为甲醇诱导表达12、24、36、48、60、72h的蛋白样品。

  图7 pPICZαA-pgc6酵母转化子真核表达的SDS-PAGE检测

  M:Protein Marker;12-72:分别为甲醇诱导表达12、24、36、48、60、72h的蛋白样品。

  3.5 PGC3-PGC6同工酶的Western blot鉴定

  利用His多抗(3/10000)和羊抗兔(1/10000)进行Western免疫反应检测。结果如图8所示,PGC3,PGC4,PGC5,PGC6分别在70 kDa、60 kDa、40 kDa、55 kDa附近具有目的条带,与SDS-PAGE检测结果相符,说明pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6酵母转化子已成功表达出目的蛋白。

  图8 PGC3-PGC6同工酶的Western blot鉴定结果

  3.6香蕉枯萎病菌PGC3-PGC6真核表达产物的粗酶活测定

  对香蕉枯萎病菌PGC3-PGC6真核表达产物进行果胶酶活性测定,结果如表4所示,PGC3~PGC6均具有果胶酶活性,说明pPICZαA-pgc3~pPICZαA-pgc6酵母转化子表达出的目的蛋白均具有活性,可用于后续的蛋白纯化研究。