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论文知识案例-不同产地升麻HPLC指纹图谱及异阿魏酸含量测定研究

2021-03-26 10:52:18

  为了控制升麻的药材质量,运用高效液相色谱法(HPLC)法,建立了不同产地升麻的指纹图谱,同时测定升麻中的异阿魏酸的含量.方法:运用高效液相色谱法得到并分析15批不同产地的升麻的指纹图谱,并求得不同产地升麻饮片中异阿魏酸的含量。结果:得到不同产地升麻的指纹图谱,其异阿魏酸的含量均符合《药典》规定。结论:高效液相色谱法可为控制升麻药材的质量提供科学的依据。

  1.1升麻的简介

  升麻,为毛茛科升麻属植物大三叶升麻Cimicifuga heracleifolia Kom、兴安升麻Cimicifuga dahurica(Turez.)maxim.或升麻Cimicifuga foetida L.的根茎。又称龙眼根、窟窿牙根。主要产自于辽宁、吉林、黑龙江,河北、山西、陕西、四川、青海等省亦产。具有解表透疹,清热解毒,升举阳气的功效。

  1.2升麻的化学成分及药理作用

  升麻主要含有机酸类、呋喃色原酮类和三萜类等成分,异阿魏酸等有机酸类是升麻的主要活性成分。其有效化学成分种类繁多,因而具有多种生物活性物质,其对机体具有抗病原微生物作用、抗炎作用;影响中枢神经系统和平滑肌;对凝血酶引起的人血纤维蛋白的凝聚时间有显著延长作用,并能抑制心脏、减慢心率、降低血压、缩短凝血时间。主治外感表证,麻疹不透,齿痛口疮,咽喉肿痛,温毒发斑,气虚下陷,脏器脱垂,崩漏下血等。

  1.3升麻的性状鉴别

  药材外形呈不规则的长形块状,大多数存在分枝,为结节状,其长度约为10~20cm,直径约为2~4cm。药材表面呈现黑褐色或者棕褐色,粗糙不平,残留有坚硬的细须根,上面有多个圆形空洞的茎基痕,洞的内壁可见网状沟纹;下面凹凸不平,具有须根痕。体轻,质坚硬,不容易折断,断面不平坦,有裂隙,呈纤维性,黄绿色或淡黄白色。气微,味微苦而涩。

  1.4升麻的应用

  升麻作为中药中的发散风热药,在临床治疗中应用的十分广泛。升麻具有“主升”、“主降”双重作用。其味辛、微甘,性微寒可见其“清降”之用,而其另一方面的透疹、升阳、清热解毒的功效能体现出它“主升”的药性。而历代采用不同炮制方法处理的升麻功效也各有不同,临床用药却以生片和蜜制片为主升麻生用时,其升散作用较强,主解表透疹,清热解毒,多用于麻疹透发不畅,常与葛根、白芍、甘草等同用。还用于头痛,牙龈肿痛,疮疡肿毒等证。炒升麻、蜜炙升麻,辛散作用减弱,对胃的刺激减小,以升脾阳为主,用于气虚下陷,久泻脱肛、子宫下垂等症。升麻常与柴胡、石膏、牛蒡子、桔梗等药材配伍使用。经典古籍中也有记载有关升麻的方剂,如十神汤、升麻葛根汤、补中益气汤、普济消毒饮等。市面上也有一些含有升麻的中成药,如宫血停颗粒、绿雪胶囊等。

  1.5实验的背景及意义

  随着现代科学技术和中药国际市场的发展,全世界对我国的中医药文化都有了更深的了解和重视。如今,多种中药相互配伍形成的中药制剂也被越来越多的人认可。近几年,中药制剂无论在剂型、治疗范围、临床效果还是销量方面都有了巨大的成果。但是我们应该注意的是,随着中药制剂的创新和发展,我们应该密切关注其质量标准的控制。

  中药制剂中的药物组成种类繁多,药材中的成分复杂多样,不同的产地、不同炮制方法、不同的药物配伍、不同的制备工艺可能都会对质量产生影响。因此,保证中药及其制剂安全、有效的首要问题是对其进行质量控制。传统的中药方剂质量控制的方法主要包括化学定量法、紫外-可见分光光度法、薄层色谱法等,随着现代分离分析技术的发展,红外光谱法、液相色谱法、气相色谱法和多维色谱联用等技术越来越多的应用于中药方剂的质量控制中。[[1]曲蕃升,邢丽媛,许丽娜.中药及其制剂现代质量控制方法研究进展[J].世界最新医学信息文摘,2016,16(72):55-59.][1]

  高效液相色谱(HPLC)是上世纪60年代末在经典液相色谱的基础上,运用气相色谱的理论和实验方法,发展起来的一种分离分析方法。有分离效率高,分析速度快,定量精度高,稳定性好,色谱柱可以反复使用的优点,不受限于样品的挥发性和热稳定性,大部分的成分可以在高效液相色谱(HPLC)分析测试,因此成为指纹图谱使用最广泛的最成熟的一种方法。由于中药成分的复杂性,选择高效液相色谱(HPLC)方法构建中药指纹图谱,一般多采用梯度洗脱的方法,它可以分离中药成分,从而可以更准确地反映中药的鉴别信息。[[2]李强,李超.中药指纹图谱研究综述[J].齐鲁药事,2010,29(03):158-161.][2]高效液相色谱法(HPLC)已被列入《药典》2005年版,用于测定479个相关物种。高效液相色谱法已成为指纹图谱分析的首选方法。

  为了更充分合理地开发与利用升麻药材,保证升麻药材的质量,优化和稳定生产工艺,控制中间体与成品一致性,提高升麻药材的疗效,特对不同产地升麻指纹图谱及异阿魏酸含量进行测定研究,为升麻饮片质量控制提供科学依据。

  2实验部分

  2.1实验材料

  2.1.1实验仪器

  表2-1实验仪器

  仪器名称型号公司

  多功能粉碎机200T永康市铂欧五金制品有限公司

  电子天平BSA124S-CW赛多利斯科学仪器(北京)有限公司

  岛津高效液相色谱仪LC-20A美国Aglient公司DND检测器

  超声波清洗器KQ5200昆山市超声仪器有限公司

  Water purifier精密型实验室专用超纯水机WP-UP-10上海捷惠科学仪器有限公司

  2.1.2实验试剂

  表2-2实验试剂

  试剂批号厂家

  甲醇(分析纯)20191031北京化工厂

  乙醇(分析纯)

  磷酸(色谱纯)190623

  197217北京化工厂

  Fisher chemical

  异阿魏酸标准品150775-201812中国药品生物制品检定所

  甲醇(色谱纯)191102 Fisher chemical

  乙腈(色谱纯)191101 Fisher chemical

  蒸馏水20191131长春中医药大学

  纯净水20191130娃哈哈

  2.1.3实验用具及药材

  铁架台,称量纸,药匙,量筒,剪刀,漏斗,滤纸,可调微量移液器(1000μl),注射器(1ml),0.45μm微孔过滤膜,液相进样瓶。不同产地的升麻,共15批次。

  2.1.4结果分析软件

  中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版功能:通过导入相关液相色谱图,使用设参照谱、多点校正、自动匹配、生成对照等功能对需要的色谱图进行比对分析。可以得到这一批色谱图的相似度等信息。[[3]李志成,闫伟,宋雯,韩京龙,张辉.一种人参连作障碍土壤改良技术的评价研究[J].中国现代中药,2017,19(11):1605-1611.DOI:10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.022][3]

  2.2实验方法

  2.2.1升麻的提取

  选取十五个批次的升麻药材,粉碎,编号升麻1号~升麻15号。

  精密称取升麻粉末1.0g,精密加入10%甲醇25ml,称一次重并记录,超声处理40分钟后取出,放凉,再次称重,并用10%甲醇补足减失的重量,取续滤液为1号供试品。

  升麻2号~15号样品的处理方法同上。

  最终得到升麻1号~15号供试品溶液。

  2.2.2对照品溶液的制备

  取异阿魏酸标准品适量,精密称定后置于棕色量瓶中,用10%乙醇制成每l ml含异阿魏酸20μg的溶液,得到对照品溶液。

  2.2.3高效液相色谱的条件

  色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×150mm,5μm);乙腈作为流动相A,0.1%的磷酸溶液作为流动相B,按表2-3进行梯度洗脱;检测波长设为316nm,流速设为0.5ml/min,柱温设为35℃。

  表2-3流动相洗脱表

  时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)

  0-15 5→15 90→94

  15-40 15→35 94→65

  40-94 35→55 65→55

  将样品溶液与标准品溶液用0.45μm滤膜过滤后开始进样,将进样量为设定为10μl。图2-1~图2-2就是得到的升麻的样品溶液和标准品溶液的高效液相色谱图。

  图2-1升麻的高效液相色谱图

  图2-2异阿魏酸的高效液相色谱图

  根据两图对比显示,标准品图谱中4号峰的保留时间与异阿魏酸吻合,所以确定4号特征峰为异阿魏酸。

  2.3方法学考察

  精密度实验:任意选取一样品溶液,连续进5次样。计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对保留峰面积的相对标准偏差(RSD)。

  表2-4方法精密度的测试结果(相对保留时间)

  共有峰1 2 3 4 5 6

  1 0.856 0.928 0.948 1.000 1.012 1.071

  2 0.853 0.923 0.943 1.000 1.010 1.073

  3 0.849 0.930 0.944 1.000 1.015 1.075

  4 0.859 0.933 0.951 1.000 1.013 1.068

  5 0.846 0.925 0.942 1.000 1.012 1.072

  RSD(%)0.548 0.382 0.358 0.000 0.162 0.216

  表2-5方法精密度的测试结果(相对保留峰面积)

  共有峰1 2 3 4 5 6

  1 0.316 0.206 0.301 1.000 0.773 0.864

  2 0.320 0.209 0.304 1.000 0.775 0.862

  3 0.319 0.207 0.312 1.000 0.769 0.894

  4 0.325 0.215 0.308 1.000 0.778 0.865

  5 0.318 0.209 0.306 1.000 0.776 0.869

  RSD(%)1.052 1.694 1.354 0.000 0.442 0.392

  由上述结果得出:相对保留时间和相对峰面积的的RSD值均在标准范围内,说明上述采用的方法的精密度良好。

  重现性实验:取样品溶液5份,以次进样。计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对保留峰面积的相对标准偏差(RSD)。

  表2-6方法重现性的测试结果(相对保留时间)

  共有峰1 2 3 4 5 6

  1 0.855 0.925 0.946 1.000 1.015 1.075

  2 0.856 0.923 0.943 1.000 1.010 1.073

  3 0.849 0.936 0.943 1.000 1.012 1.075

  4 0.858 0.933 0.951 1.000 1.016 1.069

  5 0.847 0.921 0.945 1.000 1.014 1.073

  RSD(%)0.497 0.631 0.311 0.000 0.213 0.204

  表2-7方法重现性的测试结果(相对保留峰面积)

  共有峰1 2 3 4 5 6

  1 0.319 0.208 0.306 1.000 0.772 0.865

  2 0.320 0.209 0.304 1.000 0.775 0.862

  3 0.316 0.203 0.313 1.000 0.765 0.876

  4 0.327 0.214 0.302 1.000 0.779 0.862

  5 0.318 0.209 0.306 1.000 0.776 0.869

  RSD(%)1.307 1.875 1.354 0.000 0.688 0.680

  由上述结果得出:相对保留时和相对峰面积的RSD值均在标准范围内,说明上述方法的重现性良好。

  稳定性实验:取一样品溶液,分别于第0、4、12、24、48h进样,计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(RSD)。

  表2-8样品稳定性的测试(相对保留时间)

  共有峰1 2 3 4 5 6

  0h 0.854 0.925 0.946 1.000 1.015 1.075

  4h 0.856 0.926 0.944 1.000 1.012 1.077

  12h 0.846 0.938 0.943 1.000 1.012 1.075

  24h 0.858 0.933 0.950 1.000 1.015 1.068

  48h 0.847 0.921 0.945 1.000 1.014 1.073

  RSD(%)0.634 0.733 0.286 0.000 0.150 0.320

  表2-9样品稳定性的测试(相对保留峰面积)

  共有峰1 2 3 4 5 6

  0h 0.319 0.208 0.306 1.000 0.773 0.869

  4h 0.323 0.209 0.307 1.000 0.775 0.862

  12h 0.316 0.205 0.313 1.000 0.768 0.876

  24h 0.329 0.216 0.308 1.000 0.779 0.863

  48h 0.318 0.209 0.306 1.000 0.775 0.869

  RSD(%)1.604 1.928 0.947 0.000 0.517 0.649

  由上述结果得出:相对保留时间和相对峰面积的RSD值均符合标准范围,说明样品至少在48h内保持稳定。

  3实验结果

  3.1升麻指纹图谱的建立

  将15批升麻样品色谱图导入《中药色谱指纹图谱和相似度评价系统》(2012版),选取时间窗宽度为0.1 min,以中位数生成对照色谱图,经过多点校正后自动匹配,生成升麻药材指纹图谱共有模式,[[4]光磊,李军山,孙福仁,常云凤,李雪丽,李振江.基于指纹图谱与聚类分析评价不同产地关升麻质量[J].中国现代中药,2018,20(08):953-957.DOI:10.13313/j.issn.1673-4890.20180104005][4]即具有“指纹”特点的共有峰,进而得到相关的相对保留时间、相对保留峰面积、相似度等数据。

  图3-1 15种升麻的高效液相色谱指纹图谱(检测波长:290nm)

  S1至S15为升麻1号样品至升麻15号样品R:对照谱图

  3.2升麻的高效液相色谱图的分析

  通过使用软件进行相似度的对比,从升麻的高效液相指纹图谱中选取6个共有峰。见表3-1。

  表3-1升麻药材的6个共有峰

  共有峰1共有峰2共有峰3共有峰4共有峰5共有峰6

  升麻1 5308.6 2538.9 5292.3 11221.8 9068.7 8331.5

  升麻2 6256.5 2541.3 4487.3 11027.0 8817.7 7857.7

  升麻3 5562.9 2866.3 5500.4 11214.7 9236.9 8084.7

  升麻4 5505.1 3147.3 5259.5 11168.1 9058.4 8094.5

  升麻5 6068.7 2969.1 4340.6 11930.2 8747.8 8217.0

  升麻6 6165.5 2577.5 5364.9 11197.2 9155.5 7695.6

  升麻7 5298.7 2657.3 4813.2 11038.5 8882.1 8049.2

  升麻8 6165.4 2718.0 5326.6 11184.0 9237.2 8173.9

  升麻9 5564.4 3222.6 5207.5 11171.8 9087.3 7694.8

  升麻10 5620.7 3151.7 4386.5 11930.8 8740.9 7835.1

  升麻11 5689.2 2533.2 5363.6 11160.1 9167.3 7766.2

  升麻12 5622.7 2573.1 4555.2 11018.8 8849.2 7773.6

  升麻13 5855.0 2782.8 5378.4 11196.9 9261.9 8345.3

  升麻14 5658.9 2642.9 5518.2 11267.8 9140.4 8546.4

  升麻15 5402.6 2668.6 4641.3 11040.3 8880.4 7927.3

  对照图谱5510.6 2538.9 5292.3 11221.8 9068.7 8331.5

  异阿魏酸在本试验条件下实现了最佳的吸收度和较好的分离度,峰位居中,所以把异阿魏酸色谱峰当作参照峰。计算各共有峰的相对保留时间及相对保留峰面积。

  表3-3升麻的6个共有峰的相对保留时间

  样品共有峰1共有峰2共有峰3共有峰4共有峰5共有峰6

  升麻1 0.744 0.862 0.902 1.000 1.054 1.158

  升麻2 0.755 0.857 0.886 1.000 1.078 1.147

  升麻3 0.743 0.854 0.899 1.000 1.084 1.194

  升麻4 0.753 0.863 0.936 1.000 1.088 1.148

  升麻5 0.739 0.856 0.927 1.000 1.093 1.122

  升麻6 0.747 0.888 0.908 1.000 1.084 1.187

  升麻7 0.738 0.856 0.923 1.000 1.083 1.112

  升麻8 0.737 0.853 0.890 1.000 1.090 1.150

  升麻9 0.741 0.862 0.921 1.000 1.089 1.196

  升麻10 0.743 0.851 0.913 1.000 1.053 1.112

  升麻11 0.742 0.854 0.912 1.000 1.088 1.119

  升麻12 0.746 0.885 0.893 1.000 1.081 1.117

  升麻13 0.776 0.854 0.891 1.000 1.091 1.142

  升麻14 0.742 0.866 0.922 1.000 1.080 1.135

  升麻15 0.746 0.856 0.890 1.000 1.052 1.188

  RSD(%)1.339 1.342 1.808 0.000 1.188 2.554

  表3-2升麻的6个共有峰的相对峰面积

  样品共有峰1共有峰2共有峰3共有峰4共有峰5共有峰6

  升麻1 0.444 0.262 0.402 1.000 0.874 0.758

  升麻2 0.455 0.257 0.386 1.000 0.878 0.747

  升麻3 0.443 0.254 0.399 1.000 0.884 0.750

  升麻4 0.453 0.263 0.406 1.000 0.858 0.748

  升麻5 0.439 0.256 0.407 1.000 0.893 0.722

  升麻6 0.447 0.258 0.408 1.000 0.884 0.757

  升麻7 0.438 0.256 0.403 1.000 0.853 0.742

  升麻8 0.437 0.253 0.390 1.000 0.890 0.750

  升麻9 0.451 0.262 0.401 1.000 0.889 0.946

  升麻10 0.443 0.251 0.403 1.000 0.853 0.712

  升麻11 0.442 0.254 0.412 1.000 0.888 0.749

  升麻12 0.456 0.255 0.393 1.000 0.881 0.747

  升麻13 0.446 0.254 0.391 1.000 0.891 0.742

  升麻14 0.442 0.266 0.422 1.000 0.850 0.735

  升麻15 0.446 0.256 0.396 1.000 0.882 0.948

  RSD(%)1.388 1.632 2.413 0.000 1.808 2.353

  由以上两表可以看到6个共有峰的相对保留时间和相对保留峰面积的RSD值均在标准范围内,说明这6个共有峰均为有效峰。

  3.3指纹图谱相似度计算

  采用国家药典委员会开发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件(2004A版)进行相似度评价,将色谱工作站中的数据导入该软件,以升麻样品的特征指纹图谱为参照谱图,对照图谱的生成采用中位数法,设定合适的时间窗宽度,得出升麻药材,各样品与该共有模式比较,[[5]周坚,莫传丽,陈刚,韦敏灵,範本文哲.升麻药材及其颗粒的HPLC指纹图谱质量控制研究[J].中国现代应用药学,2018,35(02):252-255.DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.02.0][5]计算得到15种样品的高效液相色谱指纹图谱的相似度,见表3-4。

  表3-4升麻的指纹图谱相似度比较

  种类相似度

  升麻1 0.906

  升麻2 0.907

  升麻3 0.932

  升麻4 0.901

  升麻5 0.922

  升麻6 0.935

  升麻7 0.926

  升麻8 0.907

  升麻9 0.972

  升麻10 0.951

  升麻11 0.902

  升麻12 0.915

  升麻13 0.956

  升麻14 0.937

  升麻15 0.942

  对照指纹图谱1.000

  从表3-4可以看出,本实验中15种样品的高效液相指纹图谱的相似度均在0.900以上,可初步判定这15批升麻样品的高效液相指纹图谱相似。

  3.4升麻中异阿魏酸的含量测定

  3.4.1线性关系考察

  将异阿魏酸标准品溶液,取2、4、6、8、10μL依次注进高效液相色谱仪中,并记录峰面积,并以进样量和峰面积为坐标进行线性回归分析并绘图。得到回归方程Y=2203.7X+128.1(r=0.9991)异阿魏酸的线性范围0.0582~0.291 mg/mL。

  图3-2线性回归方程

  3.4.2精密度实验

  取同一样品溶液,重复进样5次,并记录异阿魏酸色谱峰面积,经计算得异阿魏酸峰面积的相对标准偏差为1.201%,说明精密度良好。

  表3-5精密度实验结果

  异阿魏酸峰面积平均值RSD(%)

  1 11866.3

  2 11577.5

  3 11642.9 11680.54 1.201

  4 11533.2

  5 11782.8

  3.4.3重复性实验

  取同一批药材平行制出的5份样品溶液,分别进样并记录异阿魏酸色谱峰面积。经计算得到异阿魏酸峰面积的相对标准偏差为1.220%,说明重复性良好。

  表3-6重复性实验结果

  异阿魏酸峰面积平均值RSD(%)

  1 11538.9

  2 11463.5

  3 11236.3 11363.54 1.220

  4 11222.6

  5 11356.4

  3.4.4稳定性实验

  取一份样品溶液,分别在制出后的0,4,8,12,24 h进样,记下峰面积,经计算得异阿魏酸峰面积的相对标准偏差为0.769%,说明样品在24 h内保持稳定状态。

  表3-7稳定性实验结果

  异阿魏酸峰面积平均值RSD(%)

  0h 11541.3

  4h 11657.3

  8h 11573.1 11578.5 0.769

  12h 11668.6

  24h 11452.2

  3.4.5加样回收率实验

  精密称取3份已知异阿魏酸含量的同一批升麻药材,每份约为0.2 g,分别加入适量的标准品,按2.2.1方法制出样品溶液,以2.2.3色谱条件测定,以样品溶液中的绝对含量计算加样回收率,[[6]申安.高效液相色谱法测定不同产地当归中阿魏酸的含量[J].中医学报,2015,30(03):421-422.DOI:10.16368/j.issn.1674-8999.2015.03.142

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  表3-8加样回收率试验结果

  序号取样量

  (g)样品含量(mg)对照品加入量(mg)测得总量(mg)回收率

  (%)

  1 0.2002 1.663 1.665 3.188 95.8

  2 0.2006 1.665 1.665 3.277 98.4

  3 0.2004 1.667 1.665 3.315 99.5

  3.4.6样品含量测定

  精密称取15批不同产地的升麻细粉各1.0 g,按2.2.1项下方法制出样品溶液,每份样品测3次,计算异阿魏酸的含量,结果见表3-9。

  表3-9升麻中异阿魏酸含量测定结果