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论文案例实践-响应曲面法优化高山红景天纤维素酶辅助超声提取工

2021-03-29 09:34:03

  1 材料及仪器

  

  1.1 材料

  

  高山红景天于2019年03月购于长白山汇济堂中药店,经吉林农业科技学院刘俊霞老师鉴定为景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola)高山红景天(Rhodiola cretinii)根。

  

  1.2 试剂

  

  所用试剂如表1-1所示:

  

  表1-1 药品

  

  序号 药品 批号 生产厂家

  

  1 无水乙醇(分析纯) 20190810 天津市致远化学试剂有限公司

  

  2 冰乙酸(分析纯) 20130705 天津市进丰化工有限公司

  

  3 甲醇(色谱纯) 20180916 星马克有限公司

  

  4 柠檬酸(分析纯) 20181211 天津市致远化学试剂有限公司

  

  5 纤维素酶(50 u/mg) H16A9S58744 源叶生物

  

  1.3 仪器

  

  所用仪器如表1-2所示:

  

  表1-2 仪器

  

  序号 仪器 型号 生产厂家

  

  1 电热鼓风干燥箱 WGL-230B 上海沪粤明科学仪器有限公司

  

  2 电子天平 AX324ZH 奥豪斯仪器(常州)有限公司

  

  3 高效液相色谱仪 1260型 安捷伦有限公司

  

  4 超声波清洗器 KQ-700V 济宁天华超声电子仪器有限公司

  

  5 循环水式多用真空泵 SHB-III 郑州长城科工贸有限公司

  

  6 数显恒温水浴锅 HH-4系列 金坛市科析仪器有限公司

  

  2 方法

  

  图2-1 红景天苷提取及含量测定流程图

  

  2.1 高山红景天药材的处理

  

  2.1.1 高山红景天药材处理

  

  将高山红景天粉碎,置于55 ℃烘干箱中烘至恒重,过40目筛后备用。

  

  2.1.2 高山红景天含水量测定

  

  根据《中国药典》2015版规定,采用烘干法测定高山红景天中所含水分。高山红景天粉碎,分别精密称取2.0000g 3份,放入烧杯中精密称定重量。置入烘箱内,在100℃下干燥5h后取出,放冷后精密称定,再在上述温度下干燥1h,放冷,称重,至连续两次称重的差异不超过5 mg为止,根据减失的重量,计算供试品中含水量(%)[13]。

  

  2.2 红景天苷含量的测定

  

  2.2.1 色谱条件

  

  色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm,5 μm),流动相为0.5%冰醋酸-水溶液(A)-甲醇(B)。梯度洗脱为0~30 min 0 -55% A、30~45 min 55-100% A;流速1 mL/min;柱温30℃;在270 nm波长检测[14-15];进样量10 μL。

  

  2.2.2 对照品溶液制备

  

  精确称取红景天苷标准品1.0000 mg于5 mL的容量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,得到质量浓度均为0.2 mg/mL的对照品溶液[16]。保存在2-8℃冰箱中,备用。

  

  2.2.3 标准曲线

  

  按照“2.2.1”的色谱条件进样2、4、6、8、10 μL检测。以质量浓度(x)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标[17]。

  

  2.3 方法学考察

  

  2.3.1 精密度试验

  

  按照“2.2.1”的色谱条件对对照品溶液进行色谱分析(n=5),记录峰值面积[18]。

  

  2.3.2 重复性试验

  

  从同一批次取5个样品后,按“2.2.2”方法制备供试品溶液,按照“2.2.1”的色谱条件进行色谱分析并记录峰值面积[17]。

  

  2.3.3 稳定性试验

  

  按照“2.2.1”色谱条件分别在4、8、12、16、20和24 h对同一样品溶液进行色谱分析并记录峰面积[17]。

  

  2.3.4 加样回收率试验

  

  按照“2.2.2”的方法制备样品溶液(n=5),精密加入适量对照品溶液,并根据“2.2.1”的色谱条件进行色谱分析[17]。

  

  2.4 单因素对红景天苷提取含量的影响

  

  2.4.1 超声时间的筛选

  

  精密称取高山红景天粉末1.0000 g,加入纤维素酶,按照如下表2-1所示进行超声提取,用40%乙醇定容至25 mL容量瓶中。抽取10 μL样品按“2.2.1”色谱条件进行数据分析,以红景天苷含量(y)为纵坐标,提取时间(x)为横坐标绘制曲线。

  

  表2-1 不同提取时间对提取含量的影响(n=3)

  

  时间(min) 纤维素酶质量

  

  分数(%) 温度(℃) 乙醇浓度(%) 次数(次)

  

  20、30、40、50、60 0.2 40 40 2

  

  2.4.2 纤维素酶质量分数的筛选

  

  精密称取高山红景天粉末1.0000 g,加入纤维素酶,按照如下表2-2所示进行超声提取,用40%乙醇定容至25 mL容量瓶中。抽取10 μL样品按“2.2.1”色谱条件进行数据分析,以红景天苷含量(y)为纵坐标,提取时间(x)为横坐标绘制曲线。

  

  表2-2 不同纤维素酶质量分数对提取含量的影响(n=3)

  

  时间(min) 纤维素酶质量

  

  分数(%) 温度(℃) 乙醇浓度(%) 次数(次)

  

  30 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4 40 40 2

  

  2.4.3 提取温度的筛选

  

  精密称取高山红景天粉末1.0000 g,加入纤维素酶,按照如下表2-3所示进行超声提取,用40%乙醇定容至25 mL容量瓶中。抽取10 μL样品按“2.2.1”色谱条件进行数据分析,以红景天苷含量(y)为纵坐标,提取时间(x)为横坐标绘制曲线。

  

  表2-3 不同提取温度对提取含量的影响(n=3)

  

  时间(min) 纤维素酶质量

  

  分数(%) 温度(℃) 乙醇浓度(%) 次数(次)

  

  30 0.2 30、40、50、60、70 40 2

  

  2.4.4 乙醇浓度的筛选

  

  精密称取高山红景天粉末1.0000 g,加入纤维素酶,按照如下表2-4所示进行超声提取,用40%乙醇定容至25 mL容量瓶中。抽取10 μL样品按“2.2.1”色谱条件进行数据分析,以红景天苷含量(y)为纵坐标,提取时间(x)为横坐标绘制曲线。

  

  表2-4 不同乙醇浓度对提取含量的影响(n=3)

  

  时间(min) 纤维素酶质量

  

  分数(%) 温度(℃) 乙醇浓度(%) 次数(次)

  

  30 0.2 40 30、40、50、60、70 2

  

  2.4.5 提取次数的筛选

  

  精密称取高山红景天粉末1.0000 g,加入纤维素酶,按照如下表2-5所示进行超声提取,用40%乙醇定容至25 mL容量瓶中。抽取10 μL样品按“2.2.1”色谱条件进行数据分析,以红景天苷含量(y)为纵坐标,提取时间(x)为横坐标绘制曲线。

  

  表2-5 不同提取次数对提取含量的影响(n=3)

  

  时间(min) 纤维素酶质量

  

  分数(%) 温度(℃) 乙醇浓度(%) 次数(次)

  

  30 0.2 40 40 1、2、3、4、5

  

  2.5 响应面法优化红景天苷超声提取工艺

  

  运用Design-Expert8.0.6软件进行Box-Benhnken的响应曲面试验设计,综合单因素考察结果,选取四个最优提取因素,以红景天苷含量为衡量指标,采用四因素三水平的响应面分析方法进行实验设计。

  

  3 结果

  

  3.1 含水量测定结果

  

  高山红景天含水量测量如表3-1所示:

  

  表3-1高山红景天含水量测量结果

  

  试验号 烘前试样重(g) 烘后试样重(g) 含水量(%) 平均含水量(%)

  

  1

  

  2

  

  3 2.0000

  

  2.0000

  

  2.0000 1.807

  

  1.802

  

  1.801 9.65

  

  9.90

  

  9.95 9.83

  

  最终所得含水量为9.83%。

  

  3.2 标准曲线及色谱图

  

  红景天苷标准曲线为图3-1:

  

  图3-1 红景天苷标准曲线

  

  红景天苷标准曲线为图3-1线性回归方程为y=38.175x+4.25,R2=0.9999;色谱图见图3-2。

  

  图3-2 高效液相色谱图

  

  A:红景天苷对照品溶液;B:高山红景天样品溶液

  

  3.2 方法学考察结果分析

  

  3.2.1 精密度考察结果

  

  表3-2 精密度试验研究结果(n=6)

  

  序号 峰面积(A) RSD(%)

  

  1 112.3

  

  2 116.9

  

  3 114.3 0.87

  

  4 113.2

  

  5 113.6

  

  6 111.0

  

  精密度考察RSD为0.87%,结果表明检测仪器精密。

  

  3.2.2 重复性试验结果

  

  表3-3 重复性分析表(n=3)

  

  序号 含量(mg/g) RSD(%)

  

  1 4.43 0.84

  

  2 4.32

  

  3 4.29

  

  重复性试验RSD为0.84%,结果表明试验操作重现好。

  

  3.2.3 稳定性试验结果

  

  表3-4 稳定性分析表(n=6)

  

  时间(h) 峰面积(A) RSD(%)

  

  4 104.5 0.69

  

  8 105.7

  

  12 105.3

  

  16 105.7

  

  20 104.7

  

  24 102.8

  

  稳定性试验RSD为0.69%,结果表明在0~24 h内提取药物稳定。

  

  3.2.4 加样回收率试验结果

  

  表3-5 加样回收率表(n=5)

  

  序号 样品取样量(g) 样品含量

  

  (mg) 对照品加入量(mg) 测的量(mg) 回收率

  

  (%) 平均回收率(%) RSD

  

  (%)

  

  1 0.0755 0.4768 0.4700 0.8584 98.1915 97.6155 0.82

  

  2 0.0758 0.4787 0.4700 0.8732 98.7823

  

  3 0.0766 0.4839 0.4700 0.8678 96.6172

  

  4 0.0769 0.4858 0.4700 0.8806 98.8479

  

  5 0.0748 0.4722 0.4700 0.8514 95.6386

  

  加样回收率试验RSD为0.82%,结果表明试验方法可行。

  

  3.3 单因素结果分析

  

  3.3.1 不同超声时间的筛选

  

  表3-6 不同超声时间的筛选

  

  超声时间(min) 峰面积(A) 含量(mg/)

  

  20 159.5 2.30

  

  30 198.0 2.85

  

  40 200.4 2.89

  

  50 202.7 2.92

  

  60 205.0 2.95

  

  图3-3 超声时间对提取含量的影响

  

  由图3-3可知,时间的不断增长,红景天苷提取含量变化的整体呈先增长、后平缓的趋势,药材中的红景天苷随着时间的增加而逐渐溶解,药材中的红景天苷被提取了出来,但当提取时间超过30 min时药材中红景天苷已完全溶出随时间的增加而不再发生变化,所以红景天苷提取率趋于平缓,因此,本试验做出优化考察的提取时间为20,30,40 min。

  

  3.3.2 不同纤维素酶质量分数的筛选

  

  表3-7 不同纤维素酶质量分数的筛选

  

  纤维素酶质量分数(%) 峰面积(A) 含量(mg/)

  

  0.00 77.2 1.11

  

  0.10 122.0 1.76

  

  0.20 205.3 2.96

  

  0.30 208.6 2.98

  

  0.40 211.5 3.01

  

  图3-4 纤维素酶质量分数对提取含量的影响

  

  由图3-4可知,随着纤维素酶质量分数的增加,红景天苷的提取含量也逐渐提高。药材中的红景天苷随着纤维素酶的增加而被提取了出来,但当提纤维素酶质量分数超过0.2%时药材中红景天苷已完全溶出随纤维素酶的增加而不再发生变化,所以红景天苷提取率趋于平缓,因此,本试验做出优化考察的酶质量分数为0,0.2%,0.3%。

  

  3.3.3 不同超声温度的筛选

  

  表3-8 不同提取温度的筛选

  

  超声温度(℃) 峰面积(A) 含量(mg/)

  

  30 172.6 2.48

  

  40 196.6 2.83

  

  50 197.3 2.85

  

  60 198.4 2.86

  

  70 200.2 2.85

  

  图3-5 提取温度对提取含量的影响

  

  由图3-5可知,随着提取温度的增加,红景天苷的提取含量也逐渐提高。药材中的红景天苷随着温度的增加而逐渐被提取了出来,但当提取温度超过40℃时药材中红景天苷已完全溶出随温度的增加而不再发生变化,所以红景天苷提取率趋于平缓,因此,本试验做出优化考察的提取温度为30,40,50℃。

  

  3.3.4 不同乙醇浓度的筛选

  

  表3-9 不同乙醇浓度的筛选

  

  乙醇浓度(%) 峰面积(A) 含量(mg/)

  

  30 207.2 2.99

  

  40 240.3 3.47

  

  50 244.1 3.48

  

  60 246.5 3.50

  

  70 250.2 3.49

  

  图3-6 乙醇浓度对提取含量的影响

  

  由图3-6可知,红景天苷的提取含量随着乙醇浓度的升高而提高,药材中的红景天苷溶解度逐渐增大药材中的红景天苷被提取出来,但当乙醇浓度到达50%时单因素中乙醇体积分数对于红景天苷提取率的影响到达最高值,此时药材中的红景天苷在此浓度下的溶解度达到最大值,当乙醇浓度超过50%并逐渐升高,药材对试剂的承受极性达到最大值,药材中的红景天苷溶解度也逐渐降低,为了节省试剂成本,因此,本试验做出优化考察的乙醇体积分数30%、40%、60%。

  

  3.3.5 不同的提取次数的筛选

  

  表3-10 不同乙醇浓度的筛选

  

  提取次数(次) 峰面积(A) 含量(mg/)

  

  1 223.7 3.22

  

  2 265.5 3.98

  

  3 275.8 3.97

  

  4 277.3 3.99

  

  5 278.5 4.02

  

  图3-5 提取次数对提取含量的影响

  

  由图3-5可知,提取次数的增多,红景天苷的提取含量增高,药材中的红景天苷的溶出度随着提取溶剂用量的增加而增大,当提取次数达到2次时药材中红景天苷溶出度达到最大值,超过2次后药材中红景天苷被全部提出,提取量率趋于平缓,对于后面3~5次提取发现提取率基本不再发生变化,对提取率影响较小,并且次数不易改变,在多次试验之后发现由于提取药材的量较小提取影响因素不明显,所以,将次数固定为提取两次,因此不再考察提取次数的影响。

  

  3.4 正交试验结果及分析

  

  通过单因素优选出水平及因素,做出正交试验水平表,如表3-11:

  

  表3-11 正交试验水平表

  

  水平 因素

  

  A提取时间

  

  (min) B纤维素酶质量

  

  分数(%) C提取温度

  

  (℃) D乙醇浓度

  

  (%)

  

  -1 20 0 30 30

  

  0 30 0.2 40 40

  

  1 40 0.3 50 50

  

  表3-12 红景天苷提取试验Box-benhnken结果

  

  序号 X1 X2 X3 X4 红景天苷含量

  

  (mg/g)

  

  1 40 0.2 40 50 1.82

  

  2 40 0.3 40 40 1.76

  

  3 30 0.2 30 50 0.46

  

  4 30 0.2 50 50 1.98

  

  5 30 0 30 40 2.36

  

  6 20 0.2 40 50 2.79

  

  7 20 0.3 40 40 2.96

  

  8 20 0.2 40 30 2.55

  

  9 40 0.2 30 40 0.98

  

  10 30 0.2 50 30 2.46

  

  11 30 0 40 50 2.12

  

  12 40 0.2 50 40 1.82

  

  13 30 0.2 40 40 4.49

  

  14 30 0.2 40 40 4.49

  

  15 30 0.2 30 30 1.12

  

  16 30 0.3 30 40 2.34

  

  17 30 0.2 40 40 4.49

  

  18 30 0.3 40 30 2.61

  

  19 30 0 40 30 2.24

  

  20 30 0.2 40 40 4.49

  

  21 20 0.3 50 40 3.81

  

  22 30 0.2 40 40 4.49

  

  23 20 0 40 40 2.21

  

  24 30 0.2 40 40 4.49

  

  25 40 0.2 40 30 2.35

  

  26 30 0.3 40 50 2.07

  

  27 20 0.2 50 40 2.11

  

  28 30 0 50 40 2.89

  

  29 20 0.2 30 40 0.83

  

  运用Design-Expert8.0.6软件分析表3-11中的数据,得到红景天苷对乙醇浓度(X1)、液料比(X2)、提取次数(X3)、提取功率(X4)的二元多项模型方程分别为:Y红景天苷=+2.87-0.23* X1+0.043* X2+0.41* X3-0.16* X4-0.15* X1 * X2-0.100* X1 * X3-0.15* X1* X4-0.12* X2 * X3-0.096* X2 * X4+0.042* X3 * X4-0.57* X12-0.16* X22-0.83* X32-0.49* X42

  

  表3-13 红景天苷Box-benhnken试验回归模型的方差分析

  

  方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性

  

  模型 9.52 14 0.68 3.48 0.0070 极显著

  

  A-提取时间 0.66 1 0.66 3.38 0.0873

  

  B-乙醇体积分数 0.23 1 0.23 0.12 0.7385

  

  C-纤维素酶含量 0.05 1 0.05 0.52 0.0059

  

  D-提取温度 0.31 1 0.31 1.60 0.2259

  

  AB 0.089 1 0.089 0.46 0.5095

  

  AC 0.040 1 0.040 0.20 0.6581

  

  AD 0.084 1 0.084 0.43 0.5214

  

  BC 0.057 1 0.057 0.29 0.5966

  

  BD 0.037 1 0.037 0.19 0.6709

  

  CD 7.031E-003 1 7.031E-003 0.036 0.8522

  

  A2 2.11 1 2.11 10.82 0.0054

  

  B2 0.17 1 0.17 0.88 0.3639

  

  C2 4.44 1 4.44 22.74 0.0003

  

  D2 1.56 1 1.56 7.98 0.0135

  

  残差 2.73 14 0.20

  

  失拟项 2.73 10 0.27 2.51

  

  纯误差 0.000 4 0.000

  

  总和 12.25 28

  

  对红景天苷进行方差分析,数据见表3-12。红景天苷模型的P值(P红景天苷=0.0070),结果表明该模型对超声提取工艺的影响极显著。R红景天苷2=0.8676;变异系数(C·V%)为12.2%、22.34%、26.15%、33.41%;Radj红景天苷2=0.8953;综合分析表明模拟程度良好,试验误差较小。根据回归方程中的各项系数及表3-8回归方程的方差结果可知,所选的因素对红景天苷的提取含量的影响顺序为:纤维素酶含量﹤乙醇体积分数﹤提取温度﹤提取时间。

  

  图3-6 红景天苷提取条件交互作用图

  

  响应面曲面能够较好的反应单因素或两因素相互作用对红景天苷含量的影响,响应面三维图像如图3-6所示。通过图中相应面的弯曲程度,表明纤维素酶含量对红景天苷含量影响最大,其次为乙醇体积分数以及提取温度,提取时间影响最小。

  

  运用Design-Expert8.0.6软件优化后微波提取木脂素的最佳工艺条件为:提取时间33 min,纤维素酶质量分数0.2%,提取温度38.4℃和乙醇浓度41.97%。考虑到超声温度参数为整数及实际生产条件,将优化后提取条件调整为提取时间为30 min,纤维素酶质量分数0.2%,提取温度38℃和乙醇浓度为41%。

  

  3.5 验证试验

  

  3.5.1 加入纤维素酶试验

  

  称取1.0000高山红景天,加入体积分数为0.2%的纤维素酶,调pH值为5,45℃恒温水浴下酶解30 min,加入5 mL 浓度为40%的乙醇溶液,置于40℃超声波清洗器中,设定超声波功率为100 W提取30 min,提取两次。将滤液进定容至25 mL容量瓶中,抽取10 μL样品按“2.2.1”色谱条件测其含量。

  

  表3-13 加入纤维素酶(n=3)

  

  峰面积(A) 提取率(%) 含量(mg/g)

  

  295.7 9.50 4.39

  

  提取率为9.50%,提取含量为4,39mg/g。

  

  3.5.2 未加入纤维素酶试验

  

  称取1.0000 g高山红景天,不加入纤维素酶,调pH值为5,45℃恒温水浴下酶解30 min,加入5 mL浓度为40%的乙醇溶液,置于40℃超声波清洗器中,设定超声波功率为100 W提取30 min,提取两次。将滤液进定容至25 mL容量瓶中,抽取10 μL样品按“2.2.1”色谱条件测其含量。

  

  表3-14 未加入纤维素酶(n=3)

  

  峰面积(A) 提取率(%) 含量(mg/g)

  

  40.2 1.28 0.48

  

  根据试验数据显示,未加入纤维素酶的红景天苷提取率为1.28%,提取含量为0.48mg/g,所以加入纤维素酶后红景天苷提取率明显提高,最优提取条件为提取时间30 min,纤维素酶质量分数0.2%,提取温度38℃和乙醇浓度41%。此条件下的提取率为9.50%,提取含量为4.39mg/g。